Minimum Volum Vitrifisering av umodne Feline Oocytes
Summary
Dette manuskriptet beskriver en protokoll for minimum volum vitrifisering av umodne kattocytter med laboratorie-laget media på kommersielle støtter. Det dekker hvert trinn fra oocyte isolasjon fra ex vivo gonads til vitrifisering og oppvarming.
Abstract
I ville dyrs bevaringsprogrammer er gamete banktjenester avgjørende for å beskytte genetiske ressurser til verdifulle individer og sjeldne arter og for å fremme bevaring av biologisk mangfold. I felids er de fleste arter truet med utryddelse, og innenlandske raser brukes som modell for å øke effektiviteten av protokoller for germplasm banktjenester. Blant oocyte kryopreservation teknikker, vitrifisering er mer og mer populært i menneskelig og veterinær assistert reproduksjon. Kryotop vitrifisering, som først ble utviklet for humane oocytter og embryoer, har vist seg å være godt egnet for kattocytter. Denne metoden gir flere fordeler, for eksempel gjennomførbarheten i feltforhold og hastigheten på prosedyren, noe som kan være nyttig når flere prøver må behandles. Effektiviteten er imidlertid sterkt avhengig av operatørens ferdigheter, og intra- og interlaboratoriestandardisering er nødvendig, samt personellopplæring. Denne protokollen beskriver minimum volum vitrifisering av umodne feline oocytes på en kommersiell støtte i en trinnvis feltvennlig protokoll, fra oocyte samling til oppvarming. Etter protokollen, bevaring av oocyte integritet og levedyktighet ved oppvarming (så høyt som 90%) kan forventes, selv om det fortsatt er rom for forbedring i ettervarmende modning og embryonale utviklingsresultater.
Introduction
Kryopreservation har blitt et viktig skritt for assistert reproduksjonsteknikker (ARTs). Hos mennesker tillater det bevaring av fruktbarhet eller utsettelse av foreldreskap av medisinske eller personlige grunner. Hos dyr er det nødvendig å overvinne avstand og tid i planlagte parring, spesielt hos husdyr og kjæledyr, eller for å bevare genetisk materiale av verdifulle i bevaringsprogrammer, spesielt i ville truede arter. Gamete cryopreservation er det beste valget når individene som skal avles ikke har blitt valgt ennå eller for å unngå etiske problemer forbundet med embryofrysing, spesielt i menneskelig medisin1. Spermatozoa er relativt lett å bevare og gi tilfredsstillende resultater etter tining, men oocytes, på grunn av deres strukturelle egenskaper, kan være mer komplisert å lagre. Faktisk begrenser det lave overflate / volumforholdet, samt tilstedeværelsen av zona pellucida rundt ooplasma, bevegelsen av kryobeskyttende midler og vann over cellen2. Videre, i husdyr inkludert felids, er de preget av en lipidrik cytoplasma, som antas å gjøre dem mer følsomme for kryopreservation3.
De fleste felids er truet, og den innenlandske katten brukes som en modell for å utvikle protokoller for germplasm bevaring takket være tilgjengeligheten av gonader fra rutinemessig ovariectomy. I ville dyr kan gonader oppnås etter elektive operasjoner eller (oftere) post-mortem,og umodne (germinal vesikkel) gametes kan hentes. Hormonell stimulering som tar sikte på å oppnå modne (metafase II) oocytes er ikke så vanlig som i humane ARTs på grunn av de etiske problemene og arten- og individuelle respons på behandlinger4.
Derfor har utviklingen av kryopreservation strategier fokusert på umodne gametes, som vanligvis kan hentes etter uventet eller plutselig død av sjeldne individer. Fra et biologisk synspunkt er det noen forskjeller i kryopreservation av umodne eller modne gametes, hver har sine fordeler. For det første er DNA mer beskyttet i umodne oocytes, hvis germinal vesikkel inneholder kromosomer omgitt av en kjernefysisk membran, mens den meiotiske spindelen av metafase II oocytes kan være mer utsatt for kryoskader5. For det andre kan forkjølelsesinduserte cytoskeletonskader påvirke spindelrotasjon, polar kroppsprofilering, pronukleær migrasjon og cytokinese, som kan ha forskjellige virkninger i henhold til oocyte utviklingsfasen, som påvirker meiose progresjon eller post-befruktning hendelser. Til slutt, og kanskje viktigst, mens modne oocytter er klare til å bli befruktet, er umodne gametes avhengig av støtte fra de omkringliggende cumulus-cellene for å gå gjennom kjernefysisk og cytoplasmatisk modning6, og dette er grunnen til at hele cumulus-oocyte komplekser (COCs) er cryopreserved. Imidlertid er tapet av cumulus celler og / eller tap av funksjonell forbindelse mellom gamete og de omkringliggende somatiske cellene trolig den mest skadelige effekten av kryopreservation av umodne COCer.
Blant kryopreservation teknikker, vitrifisering er en som kan brukes lettere i feltforhold. Sammenlignet med langsom (eller kontrollert hastighet) frysing, er vitrifisering raskere og krever ikke spesifikt utstyr, for eksempel en programmerbar fryser. For å tilfredsstille de tre grunnleggende prinsippene for vitrification (dvs. høy viskositet, koblet til høy kryobeskyttende konsentrasjon, små volumer og ultra-rask temperaturreduksjon), flere medier og støtter spesielt har blitt utviklet og brukt i katter for både umodne og modne oocytes. Fra og med enkle sugerør7ble enheter deretter utviklet for å nå målet “Minimum volum”. Cryoloop8, åpne trukket sugerør (OPS)9, plast takrenner (modifisert halm)10 og kryorør11 har blitt brukt, inntil en mer effektiv enhet (dvs. Cryotop) ble ansatt11, forbedre overlevelse og meiose gjenopptakelse. Cryotop (Supplerende figur 1) er en kommersielt tilgjengelig støtte som har blitt det valgfrie åpne systemet for vitrifisering. Utviklet for vitrifisering av menneskelige oocytter og embryoer, består den av en liten filmstripe festet til en hard plastholder, beskyttet av en plastrørhette under lagring12. Takket være brukervennligheten og den ekstreme reduksjonen i vitrifiseringsvolumet (så lite som 0,1 μL), noe som også fører til ekstremt rask kjøling og oppvarming, har denne vitrifiseringsstøtten blitt stadig mer brukt i flere arter, inkludert den innenlandske katten, der den har blitt brukt med en rekke medier13,14,15,16,17.
Formålet med dette manuskriptet er å beskrive en samling-vitrification-oppvarming protokoll, med mindre modifikasjoner fra den som opprinnelig er utviklet for menneskelige oocytes, som benytter laboratorie-laget media og kommersielle støtter for minimum volum vitrifisering og kan lett brukes i feltforhold for kryopation av umodne feline COCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oocyte kryopreservation er en avgjørende germplasm bevaring teknikk, spesielt i taxa hvor mange arter er truet, som Felidae familie. I dette manuskriptet ble det presentert en enkel og feltvennlig protokoll for vitrifisering av umodne kattocytter. Laboratoriebaserte medier, minimum volum vitrifisering støtter og opplært personell er de viktigste faktorene for suksessen til denne metoden, noe som gjør det mulig å skaffe levedyktige oocytes konsekvent og gjentatte ganger, som vist av de representative resultatene herv…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 og av Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Vi ønsker også å takke Dr. MariaGiorgia Morselli for hennes bidrag til eksperimentene herved avbildet og til bildeoppkjøp.
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
- Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
- Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
- Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Biologie du développement. 226 (2), 167-179 (2000).
- Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
- Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
- Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).
- Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
- Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
- Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
- Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
- Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
- Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
- Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility – Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
- Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
- Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
- Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
- Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
- Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
- Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).
