Nachweis der MicroRNA-Expression in den Nieren von Immunglobulin A nephropathischen Mäusen
Summary
microRNAs sind an der Pathogenese der IgA-Nephropathie beteiligt. Wir haben eine zuverlässige Methode zum Nachweis der microRNA-Expression in den Nieren eines IgA-Nephropathie-Mausmodells (HIGA-Mäuse) entwickelt. Diese neue Methode wird es erleichtern, die Beteiligung von miRNAs an der IgA-Nephropathie zu überprüfen.
Abstract
Die Immunglobulin-A-Nephropathie (IgA) ist eine Form der primären Glomerulonephritis, die durch eine abnorme Ablagerung von IgA gekennzeichnet ist und zum Nierenversagen im Endstadium führt. In den letzten Jahren wurde über die Beteiligung von microRNAs (miRNAs) an der Pathogenese der IgA-Nephropathie berichtet. Es gibt jedoch keine etablierte Methode zur Profilierung von miRNAs in der IgA-Nephropathie anhand von Kleintiermodellen. Daher haben wir eine zuverlässige Methode zur Analyse von miRNA in der Niere eines IgA-Mausmodells (HIGA-Maus) entwickelt. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die veränderten Expressionsniveaus von miRNAs in den Nieren von HIGA-Mäusen im Vergleich zu den Konzentrationen in den Nieren von Kontrollmäusen nachzuweisen. Kurz gesagt besteht diese Methode aus vier Schritten: 1) Gewinnung von Nierenproben von HIGA-Mäusen; 2) Aufreinigung der Gesamt-RNA aus Nierenproben; 3) Synthese komplementärer DNA aus Gesamt-RNA; und 4) quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) von miRNAs. Mit dieser Methode konnten wir erfolgreich die Expressionsniveaus mehrerer miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p und miR-21-5p) in den Nieren von HIGA-Mäusen nachweisen. Diese neue Methode kann auch auf andere Studien zur Profilierung von miRNAs bei IgA-Nephropathie angewendet werden.
Introduction
Die Immunglobulin A (IgA)-Nephropathie ist eine Form der primären Glomerulonephritis, die durch eine abnorme Ablagerung von IgA in der glomerulären Mesangialregion der Nieren gekennzeichnet ist 1,2. Sie ist die häufigste der primären Glomerulonephritis und führt bei 20–40 % der Patienten zu Nierenversagen im Endstadium2. Die Ursache ist noch unbekannt, aber eine anhaltende Schleimhautentzündung wurde in Verbindung gebracht 1,3. Kortikosteroide, Immunsuppressiva und Inhibitoren des Renin-Angiotensin-Systems wurden als therapeutische Methoden vorgeschlagen1,3, sind aber noch nicht vollständig etabliert3. Daher sind weitere Forschungen erforderlich, um die Ätiologie und die therapeutischen Methoden zur Behandlung der IgA-Nephropathie zu klären.
microRNAs (miRNAs) sind kleine, nicht-kodierende RNAs, die eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression spielen 4,5. Es wird berichtet, dass miRNAs an der Pathogenese verschiedener Krankheiten beteiligt sind, und einige wurden als Krankheitsbiomarker und Therapeutika identifiziert 4,5. In den letzten Jahren wurde auch über eine Assoziation zwischen miRNAs und der Pathogenese der IgA-Nephropathie berichtet 2,6,7. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass miR-148b an strukturellen Anomalien von IgA bei Patienten mit IgA-Nephropathie beteiligt ist 2,6,7, während miR-148b und let-7b als neuartige Biomarker zum Nachweis der IgA-Nephropathie7 dokumentiert wurden. Obwohl das Verständnis der Auswirkungen von miRNAs auf die IgA-Nephropathie dazu beitragen kann, die Ätiologie und Behandlungweiter aufzuklären2, wurden Standardmethoden zur Profilierung von miRNAs bei IgA-Nephropathie anhand von Kleintiermodellen noch nicht etabliert 2.
In dieser Arbeit haben wir eine einfache und zuverlässige Methode zur Messung der miRNA-Expression in den Nieren eines IgA-Nephropathie-Mausmodells (HIGA-Mäuse) entwickelt. Die HIGA-Maus ist ein charakteristischer ddY-Stamm, der einen besonders hohen Serum-IgA-Spiegel und die abnorme Ablagerung von IgA in den Nierenglomeruliaufweist 8,9,10,11. Daher können HIGA-Mäuse als IgA-Nephropathie-Mausmodell verwendet werden 8,9,10,11. Unsere Methode besteht aus vier Hauptschritten: Erstens, der chirurgischen Gewinnung von Nierenproben von HIGA-Mäusen; zweitens die Homogenisierung von Proben und die Aufreinigung der Gesamt-RNA unter Verwendung einer Spin-Säule auf Basis einer Siliziumdioxidmembran; drittens die Synthese komplementärer DNA (cDNA) aus der Gesamt-RNA mittels reverser Transkription; und viertens, der Nachweis der Expressionsniveaus von miRNA durch quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR). Die Begründung für diese Methode und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse basieren auf früheren Berichten12,13. Wir zeigen, dass dies eine nützliche Technik ist, um die miRNA-Expression in einem IgA-Nephropathie-Mausmodell genau zu messen, und dass sie zur Erleichterung der zukünftigen Erforschung von miRNAs bei IgA-Nephropathie verwendet werden könnte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit dieser neuen Methode konnten wir die Expression von miRNAs in den Nieren eines IgA-Nephropathie-Mausmodells (HIGA-Mäuse) messen. Die IgA-Nephropathie ist eine ungeklärte Erkrankung, die weiterer Forschung bedarf, um ihre Ätiologie und ihre therapeutischen Ziele zu klären 1,3. Die Gewinnung menschlicher Nierenproben ist jedoch sehr invasiv. Diese neue Technik hat insofern den Vorteil, als sie die Untersuchung der IgA-Nephropathie an Kleintieren ermöglicht…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Sarah Williams, PhD, von der Edanz Group (www.edanzediting.com) für die Bearbeitung eines Entwurfs dieses Manuskripts.
Materials
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
References
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
- Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
- Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
- Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
- Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
- Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
- Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
- Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
- Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
- Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
- Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
- Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. . How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).
