זיהוי ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של אימונוגלובולין עכברים נפרופתיים
Summary
מיקרו-רנ”א מעורבים בפתוגנזה של נפרופתיה מסוג IgA. פיתחנו שיטה אמינה לאיתור רמות ביטוי מיקרו-רנ”א בכליות של עכבר נפרופתיה מסוג IgA (עכברי HIGA). שיטה חדשה זו תקל על בדיקת מעורבות miRNA בנפרופתיה מסוג IgA.
Abstract
אימונוגלובולין A (IgA) נפרופתיה היא סוג של גלומרולונפריטיס ראשונית המאופיינת בתצהיר חריג של IgA, המוביל לאי ספיקת כליות סופנית. בשנים האחרונות דווח על מעורבות של מיקרו-רנ”א (miRNAs) בפתוגנזה של נפרופתיה מסוג IgA. עם זאת, אין שיטה מבוססת ליצירת פרופיל miRNA בנפרופתיה IgA באמצעות מודלים של בעלי חיים קטנים. לכן, פיתחנו שיטה אמינה לניתוח miRNA בכליה של מודל עכבר IgA (עכבר HIGA). מטרת פרוטוקול זה היא לזהות את רמות הביטוי המשתנות של miRNA בכליות של עכברי HIGA בהשוואה לרמות בכליות של עכברי ביקורת. בקצרה, שיטה זו מורכבת מארבעה שלבים: 1) קבלת דגימות כליה מעכברי HIGA; 2) טיהור RNA כולל מדגימות כליה; 3) סינתזה של דנ”א משלים מרנ”א כולל; ו-4) תגובת שרשרת כמותית של פולימראז בשעתוק לאחור (qRT-PCR) של miRNA. באמצעות שיטה זו זיהינו בהצלחה את רמות הביטוי של מספר miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p ו-miR-21-5p) בכליות של עכברי HIGA. שיטה חדשה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים אחרים פרופיל miRNA בנפרופתיה IgA.
Introduction
Immunoglobulin A (IgA) נפרופתיה היא סוג של glomerulonephritis ראשוני המאופיין על ידי תצהיר חריג של IgA באזור mesangial גלומרולרי הכליה 1,2. זהו הנפוץ ביותר של glomerulonephritis הראשוני ומוביל לאי ספיקת כליות סופנית ב 20%-40% מהחולים2. הסיבה עדיין לא ידועה, אך זיהום רירית מתמשך היה מעורב 1,3. קורטיקוסטרואידים, מדכאי חיסון ומעכבי מערכת רנין-אנגיוטנסין הוצעו כשיטות טיפוליות1,3, אך לא נקבעו לחלוטין3. לכן, נדרש מחקר נוסף כדי להבהיר את האטיולוגיה ואת שיטות הטיפול של טיפול נפרופתיה IgA.
מיקרו-רנ”א (miRNAs) הם רנ”א קטנים ולא מקודדים הממלאים תפקיד חשוב בוויסות ביטוי גנים 4,5. miRNA מדווחים כמעורבים בפתוגנזה של מחלות שונות, וחלקם זוהו כסמנים ביולוגיים של מחלות וסוכנים טיפוליים 4,5. בשנים האחרונות דווח גם על קשר בין miRNAs לבין הפתוגנזה של נפרופתיה IgA 2,6,7. לדוגמה, miR-148b הוכח כמעורב בהפרעות מבניות של IgA בחולים עם נפרופתיה IgA 2,6,7, בעוד miR-148b ו- let-7b תועדו כסמנים ביולוגיים חדשניים לגילוי נפרופתיה IgA7. למרות שהבנת ההשפעות של miRNA על נפרופתיה IgA עשויה לעזור להבהיר עוד יותר אטיולוגיה וטיפול 2, שיטות סטנדרטיות ליצירת פרופיל miRNA בנפרופתיה IgA באמצעות מודלים של בעלי חיים קטנים טרם נקבעו2.
כאן פיתחנו שיטה פשוטה ואמינה למדידת רמות ביטוי miRNA בכליות של עכבר נפרופתיה IgA (עכברי HIGA). עכבר HIGA הוא זן ddY אופייני המראה רמה גבוהה במיוחד של IgA בסרום ואת התצהיר החריג של IgA בגלומרולי כליות 8,9,10,11. לכן, עכברי HIGA יכולים לשמש כעכבר נפרופתיה IgA מודל 8,9,10,11. השיטה שלנו מורכבת מארבעה שלבים עיקריים: ראשית, קבלת דגימות כליה כירורגית מעכברי HIGA; שנית, הומוגניזציה של דגימות וטיהור הרנ”א הכולל באמצעות עמוד ספין מבוסס קרום סיליקה; שלישית, סינתזה של דנ”א משלים (cDNA) מסך הרנ”א באמצעות שעתוק הפוך; ורביעית, זיהוי רמות הביטוי של miRNA על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית בשעתוק לאחור (qRT-PCR). הרציונל לשיטה זו ומהימנות התוצאות מבוססים על דוחות קודמים12,13. אנו מראים כי זוהי טכניקה שימושית למדידה מדויקת של רמות ביטוי miRNA במודל עכבר נפרופתיה IgA, וכי ניתן להשתמש בה כדי להקל על מחקר עתידי של miRNA בנפרופתיה IgA.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצלחנו למדוד את רמות הביטוי של miRNA בכליות של מודל עכבר נפרופתיה IgA (עכברי HIGA) באמצעות שיטה חדשה זו. IgA נפרופתיה היא מחלה בלתי מוסברת הזקוקה למחקר נוסף כדי להבהיר את האטיולוגיה שלה ואת המטרות הטיפוליות 1,3. עם זאת, השגת דגימות כליה אנושיות היא פולשנית ביותר. טכני?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לשרה ויליאמס, PhD, מקבוצת אדנץ (www.edanzediting.com) על עריכת טיוטה של כתב יד זה.
Materials
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
References
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
- Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
- Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
- Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
- Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
- Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
- Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
- Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
- Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
- Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
- Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
- Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. . How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).
