इम्युनोग्लोबुलिन ए नेफ्रोपैथिक चूहों के गुर्दे में माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाना
Summary
माइक्रोआरएनए आईजीए नेफ्रोपैथी के रोगजनन में शामिल हैं। हमने एक आईजीए नेफ्रोपैथी माउस मॉडल (एचआईजीए चूहों) के गुर्दे में माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय विधि विकसित की है। यह नई विधि आईजीए नेफ्रोपैथी में एमआईआरएनए की भागीदारी की जांच करने की सुविधा प्रदान करेगी।
Abstract
इम्युनोग्लोबुलिन ए (आईजीए) नेफ्रोपैथी एक प्रकार का प्राथमिक ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस है जो आईजीए के असामान्य जमाव की विशेषता है, जिससे अंत-चरण गुर्दे की विफलता होती है। हाल के वर्षों में, आईजीए नेफ्रोपैथी के रोगजनन में माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) की भागीदारी की सूचना मिली है। हालांकि, छोटे पशु मॉडल का उपयोग करके आईजीए नेफ्रोपैथी में एमआईआरएनए की प्रोफाइलिंग के लिए कोई स्थापित विधि नहीं है। इसलिए, हमने एक आईजीए माउस मॉडल (एचआईजीए माउस) के गुर्दे में एमआरएनए का विश्लेषण करने के लिए एक विश्वसनीय विधि विकसित की है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य नियंत्रित चूहों के गुर्दे में स्तरों की तुलना में एचआईजीए चूहों के गुर्दे में एमआईआरएनए के परिवर्तित अभिव्यक्ति स्तर का पता लगाना है। संक्षेप में, इस विधि में चार चरण होते हैं: 1) एचआईजीए चूहों से गुर्दे के नमूने प्राप्त करना; 2) गुर्दे के नमूनों से कुल आरएनए को शुद्ध करना; 3) कुल आरएनए से पूरक डीएनए को संश्लेषित करना; और 4) एमआईआरएनए के मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर)। इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने एचआईजीए चूहों के गुर्दे में कई एमआईआरएनए (एमआईआर -155-5 पी, एमआईआर -146 ए -5 पी और एमआईआर -21-5 पी) के अभिव्यक्ति स्तर का सफलतापूर्वक पता लगाया। इस नई विधि को आईजीए नेफ्रोपैथी में एमआईआरएनए की रूपरेखा बनाने वाले अन्य अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
इम्युनोग्लोबुलिन ए (आईजीए) नेफ्रोपैथी एक प्रकार का प्राथमिक ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस है जो गुर्दे के ग्लोमेरुलर मेसांगियलक्षेत्र 1,2 में आईजीए के असामान्य जमाव की विशेषता है। यह प्राथमिक ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस में सबसे आम है और 20% -40% रोगियों में अंतिम चरण गुर्दे की विफलता की ओर जाता है। कारण अभी भी अज्ञात है लेकिन लगातार म्यूकोसल संक्रमण को 1,3 में फंसाया गया है। कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स, इम्यूनोसप्रेसेन्ट्स, और रेनिन-एंजियोटेंसिन सिस्टम इनहिबिटर को चिकित्सीय विधियों1,3 के रूप में प्रस्तावित किया गया है, लेकिन पूरी तरह से स्थापित नहीं किया गयाहै। इसलिए, आईजीए नेफ्रोपैथी के इलाज के एटियलजि और चिकित्सीय तरीकों को स्पष्ट करने के लिए आगे के शोध की आवश्यकता है।
माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) छोटे, गैर-कोडिंग आरएनए हैं जो जीन अभिव्यक्ति 4,5 को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एमआईआरएनए को विभिन्न बीमारियों के रोगजनन में शामिल होने की सूचना दी गई है, और कुछ को रोग बायोमार्कर और चिकित्सीय एजेंट 4,5 के रूप में पहचाना गया है। हाल के वर्षों में, एमआईआरएनए और आईजीए नेफ्रोपैथी के रोगजनन के बीच एक संबंध भी 2,6,7 बताया गया है। उदाहरण के लिए, एमआईआर -148 बी को आईजीए नेफ्रोपैथी 2,6,7 के रोगियों में आईजीए की संरचनात्मक असामान्यताओं में शामिल दिखाया गया था, जबकि एमआईआर -148 बी और एलईटी -7 बी को आईजीए नेफ्रोपैथी7 का पता लगाने के लिए नए बायोमार्कर के रूप में प्रलेखित किया गया था। हालांकि आईजीए नेफ्रोपैथी पर एमआईआरएनए के प्रभावों को समझने से एटियलजि और उपचार2 को और स्पष्ट करने में मदद मिल सकती है, छोटे पशु मॉडल का उपयोग करके आईजीए नेफ्रोपैथी में एमआईआरएनए की रूपरेखा के लिए मानक तरीके अभीतक स्थापित नहीं किए गए हैं।
हमने यहां एक आईजीए नेफ्रोपैथी माउस मॉडल (एचआईजीए चूहों) के गुर्दे में एमआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर को मापने के लिए एक सरल और विश्वसनीय विधि विकसित की है। एचआईजीए माउस एक विशिष्ट डीडीवाई स्ट्रेन है जो विशेष रूप से सीरम आईजीए के उच्च स्तर और किडनी ग्लोमेरुली 8,9,10,11 में आईजीए के असामान्य जमाव को दर्शाता है। इसलिए, एचआईजीए चूहों को आईजीए नेफ्रोपैथी माउस मॉडल 8,9,10,11 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारी विधि में चार प्रमुख चरण शामिल हैं: सबसे पहले, एचआईजीए चूहों से गुर्दे के नमूने प्राप्त करना; दूसरा, सिलिका झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम का उपयोग करके नमूनों को समरूप बनाना और कुल आरएनए को शुद्ध करना; तीसरा, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन का उपयोग करके कुल आरएनए से पूरक डीएनए (सीडीएनए) को संश्लेषित करना; और चौथा, मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) द्वारा एमआरएनए के अभिव्यक्ति स्तर का पता लगाना। इस विधि के लिए तर्क और परिणामों की विश्वसनीयता पिछली रिपोर्ट12,13 पर आधारित है। हम दिखाते हैं कि यह एक आईजीए नेफ्रोपैथी माउस मॉडल में एमआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर को सटीक रूप से मापने के लिए एक उपयोगी तकनीक है, और इसका उपयोग आईजीए नेफ्रोपैथी में एमआईआरएनए में भविष्य के शोध को सुविधाजनक बनाने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम इस नई विधि का उपयोग करके एक आईजीए नेफ्रोपैथी माउस मॉडल (एचआईजीए चूहों) के गुर्दे में एमआईआरएनए के अभिव्यक्ति स्तर को मापने में सक्षम थे। आईजीए नेफ्रोपैथी एक अस्पष्टीकृत बीमारी है जिसे इसके एटियलजि …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि के मसौदे को संपादित करने के लिए एडांज ग्रुप (www.edanzediting.com) से सारा विलियम्स, पीएचडी को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
References
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
- Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
- Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
- Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
- Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
- Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
- Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
- Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
- Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
- Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
- Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
- Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. . How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).
