免疫グロブリンA腎症マウスの腎臓におけるマイクロRNA発現の検出
Summary
マイクロRNAはIgA腎症の病態形成に関与しています。我々は、IgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるマイクロRNA発現レベルを確実に検出する方法を開発しました。この新しい方法は、IgA腎症におけるmiRNAの関与をチェックすることを容易にします。
Abstract
免疫グロブリンA(IgA)腎症は、IgAの異常な沈着を特徴とする原発性糸球体腎炎の一種であり、末期腎不全を引き起こします。近年、IgA腎症の病態形成にマイクロRNA(miRNA)の関与が報告されています。しかし、小動物モデルを用いてIgA腎症のmiRNAをプロファイリングする方法は確立されていません。そこで、IgAモデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるmiRNAを解析するための信頼性の高い方法を開発しました。このプロトコルの目的は、対照マウスの腎臓におけるレベルと比較した場合に、HIGAマウスの腎臓におけるmiRNAの変化した発現レベルを検出することである。簡単に言うと、この方法は4つのステップで構成されています:1)HIGAマウスから腎臓サンプルを取得します。2)腎臓サンプルからトータルRNAを精製する。3)全RNAから相補的DNAを合成する工程;4)miRNAの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)。この手法を用いて、HIGAマウスの腎臓における複数のmiRNA(miR-155-5p、miR-146a-5p、miR-21-5p)の発現量を検出することに成功しました。この新しい方法は、IgA腎症におけるmiRNAをプロファイリングする他の研究にも適用できます。
Introduction
免疫グロブリンA(IgA)腎症は、腎糸球体メサンギウム領域1,2へのIgAの異常な沈着を特徴とする原発性糸球体腎炎の一種です。これは原発性糸球体腎炎の中で最も一般的であり、患者の20%〜40%で末期腎不全を引き起こします2。原因はまだ不明ですが、持続的な粘膜感染が関係しています1,3。コルチコステロイド、免疫抑制剤、およびレニン-アンジオテンシン系阻害剤が治療法として提案されています1,3が、完全には確立されていません3。したがって、IgA腎症の病因と治療法を明らかにするには、さらなる研究が必要です。
マイクロRNA(miRNA)は、遺伝子発現の調節に重要な役割を果たす小さなノンコーディングRNAです4,5。miRNAは様々な疾患の病態形成に関与していることが報告されており、疾患バイオマーカーや治療薬として同定されているものもあります4,5。近年、miRNAとIgA腎症の病因との関連も報告されています2,6,7。例えば、miR-148bはIgA腎症患者のIgAの構造異常に関与していることが示され2,6,7、miR-148bとlet-7bはIgA腎症を検出するための新しいバイオマーカーとして文書化されました7。miRNAがIgA腎症に及ぼす影響を理解することは、病因と治療のさらなる解明に役立つ可能性がありますが2、小動物モデルを用いてIgA腎症のmiRNAをプロファイリングする標準的な方法はまだ確立されていません2。
我々は、IgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるmiRNA発現量を簡便かつ信頼性の高い方法で測定した。HIGAマウスは、腎糸球体8,9,10,11において特に高レベルの血清IgAとIgAの異常沈着を示す特徴的なddY株である。したがって、HIGAマウスは、IgA腎症モデルマウス8、9、10、11として用いることができる。私たちの方法は4つの主要なステップで構成されています:まず、HIGAマウスから腎臓サンプルを外科的に取得します。第二に、サンプルをホモジナイズし、シリカ膜ベースのスピンカラムを使用してトータルRNAを精製します。第三に、逆転写を用いて全RNAから相補的DNA(cDNA)を合成する。第四に、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)によるmiRNAの発現レベルの検出。この方法の理論的根拠と結果の信頼性は、以前の報告12,13に基づいています。本手法は、IgA腎症マウスモデルにおけるmiRNAの発現量を正確に測定するための有用な技術であり、今後のIgA腎症におけるmiRNAの研究に役立つ可能性があることを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この新しい手法を用いて、IgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるmiRNAの発現量を測定することができました。IgA腎症は原因不明の疾患であり、その病因と治療標的を明らかにするためにさらなる研究が必要です1,3。ただし、ヒトの腎臓サンプルの取得は非常に侵襲的です。この新しい技術は、小動物を用いたIgA腎症の研究を可能にするとい…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿の草稿を編集してくださったエダンツグループ(www.edanzediting.com)のサラ・ウィリアムズ博士に感謝します。
Materials
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
References
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
- Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
- Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
- Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
- Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
- Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
- Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
- Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
- Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
- Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
- Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
- Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. . How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).
