Påvisning av mikroRNA-ekspresjon i nyrene av immunoglobulin A nefropatiske mus
Summary
mikroRNA er involvert i patogenesen av IgA nefropati. Vi har utviklet en pålitelig metode for å oppdage mikroRNA-ekspresjonsnivåer i nyrene til en IgA nefropatimusemodell (HIGA-mus). Denne nye metoden vil gjøre det lettere å sjekke for miRNA involvering i IgA nefropati.
Abstract
Immunoglobulin A (IgA) nefropati er en type primær glomerulonefritt karakterisert ved unormal avsetning av IgA, noe som fører til nyresvikt i sluttstadiet. I de senere år har involvering av mikroRNA (miRNA) blitt rapportert i patogenesen av IgA-nefropati. Det finnes imidlertid ingen etablert metode for profilering av miRNA i IgA-nefropati ved bruk av smådyrmodeller. Derfor utviklet vi en pålitelig metode for å analysere miRNA i nyrene til en IgA-musemodell (HIGA-mus). Målet med denne protokollen er å oppdage de endrede ekspresjonsnivåene av miRNA i nyrene til HIGA-mus sammenlignet med nivåene i nyrene til kontrollmus. Kort fortalt består denne metoden av fire trinn: 1) innhenting av nyreprøver fra HIGA-mus; 2) rensing av totalt RNA fra nyreprøver; 3) syntetisere komplementært DNA fra totalt RNA; og 4) kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) av miRNA. Ved hjelp av denne metoden oppdaget vi vellykket ekspresjonsnivåene til flere miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p og miR-21-5p) i nyrene til HIGA-mus. Denne nye metoden kan brukes på andre studier som profilerer miRNA i IgA-nefropati.
Introduction
Immunoglobulin A (IgA) nefropati er en type primær glomerulonefritt karakterisert ved unormal avsetning av IgA i den renale glomerulære mesangialregionen 1,2. Det er den vanligste av primær glomerulonefritt og fører til nyresvikt i sluttstadiet hos 20%-40% av pasientene2. Årsaken er fortsatt ukjent, men vedvarende slimhinneinfeksjon har vært involvert 1,3. Kortikosteroider, immunsuppressiver og renin-angiotensin-systemhemmere har vært foreslått som terapeutiske metoder1,3, men er ikke fullstendig etablert 3. Derfor er det nødvendig med ytterligere forskning for å klargjøre etiologien og terapeutiske metoder for behandling av IgA nefropati.
mikroRNA (miRNA) er små, ikke-kodende RNA som spiller en viktig rolle i reguleringen av genuttrykk 4,5. miRNA er rapportert å være involvert i patogenesen av ulike sykdommer, og noen har blitt identifisert som sykdomsbiomarkører og terapeutiske midler 4,5. I de senere år er detogså rapportert en sammenheng mellom miRNA og patogenesen av IgA-nefropati 2,6,7. For eksempel ble miR-148b vist å være involvert i strukturelle abnormiteter av IgA hos pasienter med IgA-nefropati 2,6,7, mens miR-148b og let-7b ble dokumentert som nye biomarkører for påvisning av IgA-nefropati7. Selv om forståelse av effekten av miRNA på IgA-nefropati kan bidra til å belyse etiologi og behandling2 ytterligere, er det ennåikke etablert standardmetoder for profilering av miRNA i IgA-nefropati ved hjelp av små dyremodeller.
Vi utviklet her en enkel og pålitelig metode for å måle miRNA-ekspresjonsnivåer i nyrene til en IgA nefropatimusemodell (HIGA-mus). HIGA-musen er en karakteristisk ddY-stamme som viser et spesielt høyt nivå av serum IgA og unormal avsetning av IgA i nyreglomeruli 8,9,10,11. Derfor kan HIGA mus brukes som en IgA nefropati musemodell 8,9,10,11. Vår metode består av fire hovedtrinn: først, kirurgisk innhenting av nyreprøver fra HIGA mus; for det andre, homogenisering av prøver og rensing av totalt RNA ved hjelp av en silikamembranbasert spinnkolonne; for det tredje, syntetisering av komplementært DNA (cDNA) fra totalt RNA ved bruk av revers transkripsjon; og fjerde, detektere ekspresjonsnivåene av miRNA ved kvantitativ revers-transkripsjon polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR). Begrunnelsen for denne metoden og påliteligheten av resultatene er basert på tidligere rapporter12,13. Vi viser at dette er en nyttig teknikk for nøyaktig måling av miRNA-ekspresjonsnivåer i en IgA nefropatimusemodell, og at den kan brukes til å lette fremtidig forskning på miRNA i IgA-nefropati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi var i stand til å måle ekspresjonsnivåene av miRNA i nyrene til en IgA nefropatimusemodell (HIGA-mus) ved hjelp av denne nye metoden. IgA nefropati er en uforklarlig sykdom som trenger videre forskning for å klargjøre dens etiologi og terapeutiske mål 1,3. Imidlertid er innhenting av humane nyreprøver svært invasiv. Denne nye teknikken er fordelaktig ved at den tillater studier av IgA-nefropati ved bruk av små dyr og bør legge til rette for fremtidig…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Sarah Williams, PhD, fra Edanz Group (www.edanzediting.com) for redigering av et utkast til dette manuskriptet.
Materials
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
References
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
- Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
- Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
- Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
- Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
- Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
- Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
- Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
- Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
- Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
- Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
- Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. . How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).
