Måling naturligt erhvervet fagcytose-inducerende antistoffer mod plasmodium falciparum parasitter ved en Flow Cytometri-Baseret Analyse
Summary
Det overordnede mål med denne protokol er at give instruktion om, hvordan man måler kapaciteten af antistoffer til stede i sera eller plasma af personer, naturligt udsat for Plasmodium falciparum infektion, at opsonisere og fremkalde fagocytose af parasit-inficerede erythrocytter (IEs).
Abstract
Protokollen beskriver, hvordan man opretter og kører en flow cytometri-baseret fagocytose assay af Plasmodium falciparum-inficeredeerythrocytter (IEs) opsonized af naturligt erhvervet IgG antistoffer specifikke for VAR2CSA. VAR2CSA er parasitantigen, der formidler den selektive binding af IEs i moderkagen, der kan forårsage en alvorlig form for malaria hos gravide kvinder, kaldet placenta malaria (PM). Beskyttelse mod PM er medieret af VAR2CSA-specifikke antistoffer, der menes at fungere ved at hæmme placenta binding og / eller ved opsonizing IEs for fagocytose. Analysen beskæftiger sene-fase-synkroniserede IEs, der er blevet udvalgt in vitro til at udtrykke VAR2CSA, plasma / serum-antistoffer fra kvinder med naturligt erhvervet PM-specifik immunitet, og den fagocytiske cellelinje THP-1. Protokollen kan dog let ændres for at analysere antistoffers funktionalitet til parasitantigen, der findes på IE-overfladen, uanset om det er forårsaget af naturlig eksponering eller ved vaccination. Analysen tilbyder enkel og høj-throughput evaluering, med god reproducerbarhed, af et vigtigt funktionelt aspekt af antistof-medieret immunitet i malaria. Det er derfor nyttigt, når man vurderer klinisk immunitet over for P. falciparum malaria, en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed i troperne, især i Afrika syd for Sahara.
Introduction
Malaria er en vektorbåren sygdom forårsaget hos mennesker ved infektion med fem forskellige arter af slægten Plasmodium. De mest udbredte arter er P. falciparum, som også er ansvarlig for den mest sygelighed og dødelighed1. Malaria klinisk præsentation varierer fra asymptomatisk eller godartede infektioner til komplicerede / alvorlig sygdom, sidstnævnte forekommer for det meste hos børn under fem år. Eksponering for P. falciparum fremkalder ikke steril immunitet, men personer, der bor i endemiske områder, udvikler langsomt immunitet mod den kliniske sygdom. Beskyttelse er alder/ eksponering afhængig og immunitet er normalt erhvervet i løbet af de første 5-10 år af livet2. Voksne kvinder er en vigtig undtagelse, som svær malaria kan forekomme under graviditet i en klinisk præsentation kendt som placenta malaria (PM). PM er en vigtig årsag til abort, dødfødsel, for tidlig fødsel, lav fødselsvægt, fosterdød, og moder anæmi. Modstand mod PM udvikler sig over successive graviditeter3. Beskyttelse mod PM er forbundet med erhvervelse af antistoffer mod VAR2CSA-type PfEMP14,5, et inficeret erythrocyt (IE) overfladeantigen, der binder sig til chondroitinsulfat A (CSA), så IE-binding i moderkagen. Antistoffer mægle beskyttelse udfører forskellige funktionelle aktiviteter (gennemgået i6,7), herunder opsonization af IEs at fremkalde fagocytose. Tidlige in vitro-undersøgelser viste,at antistoffer kan begrænse P. falciparum vækst i nærvær af monocytter via fagocytose8,9. Nyere undersøgelser har vist, at højere niveauer af fagocytosefremkaldende antistoffer er forbundet med bedre graviditetsresultater (i forbindelse med hiv-co-infektion)10,,11, hvilket indikerer relevansen af denne effektorfunktion i det naturligt erhvervede immunrespons.
Her præsenterer vi en protokol til måling af denne funktion af antistoffer til stede i humant plasma / serum, ved hjælp af in vitro dyrkede IEs udtrykke VAR2CSA sammen med monocyt linje THP-1. Analysen har tidligere været anvendt11,12,13,14,15,16,17,18 ogbetragtes som en forbedret og lettere tilgang i forhold til tidligere mikroskop-baserede protokoller8, da det giver mulighed for test af et større antal antistof prøver i en enkelt køre ved hjælp af mindre mængder af antistof og undgå kedelige og skæv mikroskopi optælling. Selv om analysen er blevet brugt af flere laboratorier og dens udførelse er enkel nok, det kræver omhyggelig planlægning og forberedelse, derfor, en detaljeret protokol ville tillade dens anvendelse af laboratorier og forskere mangler tidligere erfaringer. Vi bruger, som et eksempel, sene-fase-synkroniserede IEs udtrykke VAR2CSA opsonized med antistoffer til stede i serum indsamlet fra kvinder med naturligt erhvervet PM-specifik immunitet. Protokollen kan dog let ændres for at analysere antistoffers funktionalitet til parasitantigen, der findes på IE-overfladen, uanset om det er forårsaget af naturlig eksponering eller ved vaccination.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen præsenteres her er tidligere blevet beskrevet ogbrugt 12,15,17,31 til at måle kapaciteten af antistoffer rettet mod overfladen af P. falciparum IEs at fremkalde opsonisation og fagocytose af THP-1 celler. Resultaterne her fokuserer på naturligt erhvervede VAR2CSA-specifikke antistoffer i plasma/serum hos kvinder, der bor i en P. falciparum endemisk region. VAR2C…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maiken Visti takkes for fremragende teknisk assistance. Dette arbejde blev delvist finansieret af et tilskud (MAVARECA II; 17-02-KU) fra Udenrigsministeriet og administreret af Danida Fellowship Centre. Bidragyderen havde ingen rolle i studiet design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskriptet.
Materials
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
- World Health Organization. World Malaria Report – 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
- Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
- Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
- Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
- Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
- Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
- Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
- Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
- Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
- Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
- Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
- Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
- Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
- Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
- Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
- Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
- Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
- Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
- Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
- Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
- Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. . Methods in Malaria Research. , (2013).
- WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s Guide. World Health Organization. , (1991).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc’yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
- Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
- Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).
