Måling naturlig ervervet phagocytosis-induserende antistoffer mot Plasmodium falciparum parasitter ved en Flow Cytometry-basert analyse
Summary
Det overordnede målet med denne protokollen er å gi instruksjon om hvordan man måler kapasiteten til antistoffer som finnes i sera eller plasma av individer, naturlig utsatt for Plasmodium falciparum infeksjon, å opsonisere og indusere fagocytose av parasitt-infiserte erytrocytter (IE).
Abstract
Protokollen beskriver hvordan du setter opp og kjører en strømningscytometribasert fagocytoseanalyse av Plasmodium falciparum-infiserteerytrocytter (IE) opsonisert av naturlig ervervede IgG-antistoffer som er spesifikke for VAR2CSA. VAR2CSA er parasittantigenet som formidler selektiv sekvestrasjon av IE i morkaken som kan forårsake en alvorlig form for malaria hos gravide kvinner, kalt placenta malaria (PM). Beskyttelse mot PM er mediert av VAR2CSA-spesifikke antistoffer som antas å fungere ved å hemme placentasequestration og/eller ved å opsonisere IE for fagocytose. Analysen benytter sene stadium-synkroniserte IEer som er valgt in vitro å uttrykke VAR2CSA, plasma / serum-antistoffer fra kvinner med naturlig ervervet PM-spesifikk immunitet, og fagocytisk cellelinje THP-1. Protokollen kan imidlertid enkelt endres for å analysere funksjonaliteten til antistoffer mot ethvert parasittantigen tilstede på IE-overflaten, enten indusert av naturlig eksponering eller ved vaksinasjon. Analysen tilbyr enkel og høy gjennomstrømningsevaluering, med god reproduserbarhet, av et viktig funksjonelt aspekt av antistoffmediert immunitet i malaria. Det er derfor nyttig når man vurderer klinisk immunitet mot P. falciparum malaria, en viktig årsak til sykelighet og dødelighet i tropene, spesielt i Afrika sør for Sahara.
Introduction
Malaria er en vektorbåren sykdom forårsaket hos mennesker ved infeksjon med fem forskjellige arter av slekten Plasmodium. Den mest utbredte arten er P. falciparum, som også er ansvarlig for den mest sykelighet og dødelighet1. Malaria klinisk presentasjon varierer fra asymptomatiske eller godartede infeksjoner til komplisert / alvorlig sykdom, sistnevnte forekommer hovedsakelig hos barn under fem år. Eksponering for P. falciparum induserer ikke steril immunitet, men personer som bor i endemiske områder utvikler langsomt immunitet mot den kliniske sykdommen. Beskyttelse er alder/eksponering avhengig og immunitet er normalt ervervet i løpet av de første 5-10 årene av livet2. Voksne kvinner er et viktig unntak, da alvorlig malaria kan oppstå under graviditet i en klinisk presentasjon kjent som placenta malaria (PM). PM er en viktig årsak til abort, dødfødsel, for tidlig levering, lav fødselsvekt, fosterdød, og mors anemi. Motstand mot PM utvikler seg over påfølgende graviditeter3. Beskyttelse mot PM er forbundet med oppkjøpet av antistoffer mot VAR2CSA-type PfEMP14,5, et infisert erytrocytt (IE) overflateantigen som binder seg til kondroitinsulfat A (CSA) som muliggjør IE-sekvestrasjon i morkaken. Antistoffer mediere beskyttelse utfører ulike funksjonelle aktiviteter (gjennomgåtti 6,7) inkludert opsonisering av IE for å indusere fagocytose. Tidlige in vitro studier viste at antistoffer kan begrense P. falciparum vekst i nærvær av monocytter via phagocytosis8,9. Nyere studier har vist at høyere nivåer av fagocytose-induserende antistoffer er forbundet med bedre graviditetsutfall (i sammenheng med HIV-samtidig infeksjon)10,11, noe som indikerer relevansen av denne effektorfunksjonen i naturlig ervervet immunrespons.
Her presenterer vi en protokoll for å måle denne funksjonen av antistoffer som finnes i humant plasma/serum, ved hjelp av in vitro kultiverte IEer som uttrykker VAR2CSA sammen med monocyttlinjen THP-1. Analysen har tidligere blitt brukt11,12,13,14,15,16,17,18 og regnes som en forbedret og enklere tilnærming sammenlignet med tidligere mikroskopbaserteprotokoller 8, siden det tillater testing av et større antall antistoffprøver i et enkelt løp ved hjelp av mindre mengder antistoff og unngår kjedelig og partisk mikroskoptelling. Selv om analysen har blitt brukt av flere laboratorier og utførelsen er enkel nok, krever det nøye planlegging og forberedelse, derfor vil en detaljert protokoll tillate anvendelse av laboratorier og forskere som mangler tidligere erfaring. Vi bruker, som et eksempel, sene fase-synkroniserte IEer som uttrykker VAR2CSA opsonisert med antistoffer tilstede i serum samlet inn fra kvinner med naturlig ervervet PM-spesifikk immunitet. Protokollen kan imidlertid enkelt endres for å analysere funksjonaliteten til antistoffer mot ethvert parasittantigen tilstede på IE-overflaten, enten indusert av naturlig eksponering eller ved vaksinasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som presenteres her har tidligere blitt beskrevet ogbrukt 12,15,17,31 for å måle kapasiteten til antistoffer rettet mot overflaten av P. falciparum IE for å indusere opsonisering og fagocytose av THP-1 celler. Resultatene som presenteres her fokuserer på naturlig ervervede VAR2CSA-spesifikke antistoffer i plasma/serum av kvinner som bor i en P. falciparum endem…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maiken Visti er takket for utmerket teknisk assistanse. Dette arbeidet ble delvis finansiert av et stipend (MAVARECA II; 17-02-KU) fra Utenriksdepartementet i Danmark og administrert av Danida Fellowship Centre. Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.
Materials
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
- World Health Organization. World Malaria Report – 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
- Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
- Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
- Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
- Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
- Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
- Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
- Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
- Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
- Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
- Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
- Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
- Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
- Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
- Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
- Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
- Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
- Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
- Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
- Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
- Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. . Methods in Malaria Research. , (2013).
- WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s Guide. World Health Organization. , (1991).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc’yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
- Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
- Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).
