Mätning Naturligt förvärvade Phagocytosis-inducerande antikroppar mot Plasmodium falciparum parasiter av en Flow Cytometry-baserade assay
Summary
Det övergripande målet med detta protokoll är att ge instruktioner om hur man mäter kapaciteten hos antikroppar som finns i sera eller plasma av individer, naturligt utsatt för Plasmodium falciparum infektion, att opsonize och inducera fagocytos av parasitinfekterade erytrocyter (IEs).
Abstract
Protokollet beskriver hur man ställer in och kör ett flöde cytometry-baserade fagocytos analys av Plasmodium falciparum-infekterade erytrocyter (IEs) opsonized av naturligt förvärvade IgG antikroppar specifika för VAR2CSA. VAR2CSA är parasiten antigen som förmedlar selektiv kvarstad av IEs i moderkakan som kan orsaka en allvarlig form av malaria hos gravida kvinnor, kallas placenta malaria (PM). Skydd från PM medieras av VAR2CSA-specifika antikroppar som tros fungera genom att hämma placentabindning och/eller genom att opsonisera IEs för fagocytos. Analysen sysselsätter sent stadium-synkroniserade IEs som har valts in vitro för att uttrycka VAR2CSA, plasma/serum-antikroppar från kvinnor med naturligt förvärvade PM-specifika immunitet, och den fagocytic cellinje THP-1. Protokollet kan dock lätt modifieras för att analysera funktionaliteten hos antikroppar mot någon parasitantigen som finns på IE-ytan, oavsett om den framkallas genom naturlig exponering eller genom vaccination. Analysen erbjuder enkel och hög genomströmning utvärdering, med god reproducerbarhet, av en viktig funktionell aspekt av antikropp-medierad immunitet i malaria. Det är därför användbart vid utvärdering av klinisk immunitet mot P. falciparum malaria, en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet i tropikerna, särskilt i Afrika söder om Sahara.
Introduction
Malaria är en vektorburen sjukdom som orsakas hos människor vid infektion med fem olika arter av släktet Plasmodium. Den mest förhärskande arten är P. falciparum, som också är ansvarig för den mest sjuklighet och dödlighet1. Malaria klinisk presentation varierar från asymtomatiska eller godartade infektioner till komplicerade/svår sjukdom, den senare förekommer mestadels hos barn under fem års ålder. Exponering för P. falciparum inducerar inte steril immunitet, men individer som lever i endemiska områden utvecklar långsamt immunitet mot den kliniska sjukdomen. Skydd är ålder/exponeringsberoende och immunitet förvärvas normalt under de första 5-10 åren i livet2. Vuxna kvinnor är ett viktigt undantag, som svår malaria kan uppstå under graviditeten i en klinisk presentation som kallas placenta malaria (PM). PM är en viktig orsak till abort, dödföddhet, för tidig leverans, låg födelsevikt, fosterdöd, och moderns anemi. Resistens mot PM utvecklas under på varandra följande graviditeter3. Skydd från PM är associerad med förvärv av antikroppar mot VAR2CSA-typ PfEMP14,5, en infekterad erytrocyt (IE) ytantigen som binder till kondroitinsulfat A (CSA) som möjliggör IE-kvarstad i moderkakan. Antikroppar medla skydd utför olika funktionella aktiviteter (ses överi 6,7) inklusive opsonization av IEs att inducera fagocytos. Tidiga in vitro-studier visade att antikroppar kan begränsa P. falciparumtillväxt i närvaro av monocyter via fagocytos8,9. Nyare studier har visat att högre nivåer av fagocytos-inducerande antikroppar är associerade med bättre graviditetsutfall (i samband med HIV-co-infektion)10,11, som anger relevansen av denna effektorfunktion i det naturligt förvärvade immunsvaret.
Här presenterar vi ett protokoll för att mäta denna funktion av antikroppar som finns i humant plasma/serum, med hjälp av in vitro odlade IEs uttrycker VAR2CSA tillsammans med monocyte linjen THP-1. Analysen har tidigare använts11,12,13,14,15,16,17,18 och anses vara en förbättrad och enklare metod jämfört med tidigare mikroskopbaserade protokoll8, eftersom det möjliggör testning av ett större antal antikroppsprover i en enda körning med mindre volymer av antikropp och undvika tråkiga och sneda mikroskopiräkning. Även om analysen har använts av flera laboratorier och dess utförande är enkelt nog, det kräver noggrann planering och förberedelser, därför skulle ett detaljerat protokoll tillåta dess tillämpning av laboratorier och forskare saknar tidigare erfarenhet. Vi använder, som ett exempel, sent stadium-synkroniserade IEs uttrycker VAR2CSA opsonized med antikroppar som finns i serum som samlats in från kvinnor med naturligt förvärvade PM-specifika immunitet. Protokollet kan dock lätt modifieras för att analysera funktionaliteten hos antikroppar mot någon parasitantigen som finns på IE-ytan, oavsett om den framkallas genom naturlig exponering eller genom vaccination.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som presenteras här har tidigare beskrivits ochanvänts 12,15,17,31 för att mäta kapaciteten hos antikroppar som riktar sig mot ytan av P. falciparum IEs att inducera opsonization och fagocytos av THP-1 celler. De resultat som presenteras här fokusera på naturligt förvärvade VAR2CSA-specifika antikroppar i plasma/serum av kvinnor som lever i en P. falciparum…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maiken Visti tackas för utmärkt tekniskt bistånd. Detta arbete finansierades delvis genom ett bidrag (MAVARECA II; 17-02-KU) från Danmarks utrikesdepartement och administrerades av Danida Fellowship Centre. Finansiären hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller utarbetande av manuskriptet.
Materials
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
- World Health Organization. World Malaria Report – 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
- Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
- Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
- Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
- Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
- Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
- Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
- Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
- Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
- Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
- Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
- Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
- Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
- Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
- Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
- Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
- Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
- Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
- Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
- Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
- Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. . Methods in Malaria Research. , (2013).
- WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s Guide. World Health Organization. , (1991).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc’yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
- Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
- Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).
