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Biologie

오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

Published: July 21, 2020
doi:
10.3791/61541
, , , , ,
1Lung and Regenerative Medicine Institutes, Department of Medicine,Cedars-Sinai Medical Center

Summary

이 기사는 인간 폐의 근위 및 원위 영역으로부터 생존 가능한 상피 세포의 농축을 허용하는 조직 해리 및 세포 분획화 접근법에 대한 상세한 방법론을 제공한다. 본원에서 이러한 접근법은 3D 오가노이드 배양 모델의 사용을 통한 폐 상피 전구 세포의 기능적 분석에 적용된다.

Abstract

상피 오가노이드 모델은 장기 시스템의 기본 생물학을 연구하고 질병 모델링을 연구하는 데 유용한 도구 역할을합니다. 오가노이드로서 성장할 때, 상피 전구 세포는 생체 내 대응물과 유사한 세포 기능을 나타내는 분화 자손을 스스로 갱신하고 생성할 수 있다. 여기에서 우리는 인간 폐에서 지역 특정 선조를 분리하고 실험 및 검증 도구로서 3D 오가노이드 배양물을 생성하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 우리는 영역 특이적 전구 세포를 분리하는 것을 목표로 폐의 근위 및 원위 영역을 정의합니다. 우리는 폐와 기관으로부터 전체 세포를 분리하기 위해 효소 및 기계적 해리의 조합을 이용했습니다. 이어서, 특정 전구 세포를 기저 세포를 분류하기 위한 NGFR 및 폐포 유형 II 세포를 분류하기 위한 HTII-280과 같은 세포 유형 특이적 표면 마커에 기초한 형광 관련 세포 분류 (FACS)를 사용하여 근위 또는 원위 기원 세포로부터 분획화하였다. 분리된 기저 또는 폐포 유형 II 전구물질을 사용하여 3D 오가노이드 배양물을 생성하였다. 원위 및 근위 선조는 모두 30 일째에 5000 세포 / 웰을 도금 할 때 원위 영역에서 9-13 %, 근위 영역에서 7-10 %의 콜로니 형성 효율을 가진 오가노이드를 형성했습니다. 원위 오가노이드는 배양물에서 HTII-280+ 폐포 유형 II 세포를 유지한 반면, 근위 오가노이드는 30일째까지 섬모 및 분비 세포로 분화되었다. 이러한 3D 오가노이드 배양은 폐 상피 및 상피 중간엽 상호작용의 세포 생물학을 연구하기 위한 실험 도구로서뿐만 아니라, 질병에서 상피 기능장애를 표적으로 하는 치료 전략의 개발 및 검증을 위한 실험 도구로 사용될 수 있다.

Introduction

인간 호흡 시스템의 공역은 크게 가스의 수송과 상피 – 미세 혈관 장벽을 가로 지르는 후속 교환을 매개하는 전도 구역과 호흡 영역으로 나눌 수 있습니다. 전도 기도에는 기관지, 기관지, 세기관지 및 말단 세기관지가 포함되며 호흡기 공기 공간에는 호흡기 세기관지, 폐포관 및 폐포가 포함됩니다. 이러한 영공의 상피 라이닝은 각 기능적으로 구별되는 구역의 고유한 요구 사항을 수용하기 위해 근위축을 따라 구성이 바뀝니다. 기관지 기도의 의사 층화 상피는 브러시, 신경 내분비 및 이온성 세포 1,2,3을 포함한 덜 풍부한 세포 유형 외에도 기저, 분비 및 섬모의 세 가지 주요 세포 유형으로 구성됩니다. Bronchiolar 기도는 형태학적으로 유사한 상피 세포 유형을 가지고 있지만, 풍부함과 기능적 특성에는 구별이 있습니다. 예를 들어, 기저 세포는 기관지 기도 내에 덜 풍부하며, 분비 세포는 기관지-기관지 기도에서 우세한 장액성 및 잔 세포에 비해 클럽 세포의 더 큰 비율을 포함한다.  호흡 영역의 상피 세포는 폐포관 및 폐포 1,4의 폐포 유형 I (ATI) 및 유형 II (ATII) 세포 이외에 호흡 세기관지에서 잘못 정의된 입방체 세포 유형을 포함한다.

각 구역에서 상피의 유지 및 재생에 기여하는 상피 줄기 및 전구 세포 유형의 동일성은 불완전하게 기술되고 동물 모델 5,6,7,8의 연구로부터 크게 추론된다. 생쥐에 대한 연구에 따르면 의사 층화 된 기도의 기저 세포 또는 기관지 기도의 클럽 세포 또는 폐포 상피의 ATII 세포는 무제한의 자기 재생 및 분화 능력을 기반으로 상피 줄기 세포 역할을한다는 것을 보여주었습니다 7,9,10,11,12 . 인간 폐 상피 세포 유형의 줄기를 평가하기 위해 유전 적 혈통 추적 연구를 수행 할 수 없음에도 불구하고, 상피 줄기 및 전구 세포의 기능적 잠재력을 평가하기위한 오가노이드 기반 배양 모델의 가용성은 마우스와 인간 13,14,15,16,17 사이의 비교 연구를위한 도구를 제공합니다.

우리는 인간 폐의 다른 영역에서 상피 세포 유형을 분리하는 방법과 지역 세포 유형을 재조정하기 위해 3D 오가노이드 시스템을 사용하여 배양하는 방법을 설명합니다. 유사한 방법들이 다른 기관 시스템들로부터의 상피 세포의 기능적 분석 및 질병 모델링을 위해 개발되었다 18,19,20,21. 이러한 방법은 지역 상피 전구 세포의 확인, 그들의 조절 및 미세 환경을 조사하는 기계론적 연구를 수행하고, 질병 모델링 및 약물 발견을 가능하게하는 플랫폼을 제공합니다. 동물 모델에서 수행된 폐 상피 전구 세포에 대한 연구가 생체내 또는 시험관내 분석으로부터 이익을 얻을 수 있음에도 불구하고, 인간 폐 상피 전구 세포의 동일성에 대한 통찰력은 모델 유기체로부터의 외삽에 크게 의존해 왔다. 따라서 이러한 방법은 인간 폐 상피 세포 유형의 정체성과 행동을 줄기 / 전구 세포의 조절을 조사하는 연구와 관련시키는 다리를 제공합니다.

Protocol

인간의 폐 조직은 국제 의학 진흥 연구소 (IIAM)가 개발 한 동의 절차에 따라 사망 한 조직 기증자로부터 얻었으며 Cedars-Sinai Medical Center 내부 검토위원회의 승인을 받았습니다. 1. 기관지 또는 소기도/실질(소기도 및 폐포) 부위에서 폐 세포를 분리하기 위한 조직 처리 세포 격리 하루 전에 모든 해부 장비, 유리 제품 및 적절한 솔루션을 준비하고 오토클레이브하십시오.</…

Representative Results

근원 폐 조직기관 및 폐외 기관지 (도 1A)를 근위 기도 상피 세포의 단리와 근위 오가노이드의 후속 생성을 위한 공급원 조직으로서 사용하였다. 실질종 및 직경 2mm 미만의 작은 기도를 모두 포함하는 원위 폐 조직(도 1A)은 작은 기도 및 폐포 상피 세포(원위 폐 상피)의 단리와 작은 기도 또는 폐포 오가노이드의 생성을 위해 사용되었다. ?…

Discussion

우리는 분자 또는 기능적 분석 및 질병 모델링을 위해 인간 폐 조직으로부터 폐 세포의 정의 된 하위 집단을 분리하기위한 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 방법의 중요한 요소에는 갓 분리된 세포의 항체 매개 농축을 허용하는 표면 에피토프의 보존과 함께 조직 해리를 달성하는 능력, 및 영역 특이적 상피 오가노이드의 효율적인 생성을 위한 배양 방법의 최적화가 포함된다. 우리는 입체 배양…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

IFC 및 H 및 E 염색을 위한 Mizuno Takako, 조직 절편을 위한 Vanessa Garcia, 원고 준비를 도와준 Anika S Chandrasekaran의 지원에 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) 및 Celgene IDEAL 컨소시엄의 지원을 받습니다.

Materials

Cell Isolation
10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip Fisher scientific BD 309646
30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip VWR BD302832
Biohazard bags VWR 89495-440
Biohazard bags VWR 89495-440
connecting ring Pluriselect 41-50000-03
Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) sigma Aldrich DN25-1G
Disposable Petri dishes Corning/Falcon 25373-187
Funnel Pluriselect 42-50000
HBSS Corning 21-023
Liberase TM Research Grade sigma Aldrich 5401127001
needle 16G VWR 305198
needle 18G VWR 305199
PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50100-51
PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50300-03
PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50040-51
PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50500-03
PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) Pluriselect 43-50070-51
Razor blades VWR 55411-050
Red Blood Cell lysis buffer eBioscience 00-4333-57
Equipment’s
GentleMACS C Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS Octo Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-095-937
Leica ASP 300s Tissue processor
LS Columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MultiStand** Miltenyi Biotech 130-042-303
Thermomixer Eppendorf 05-412-503
Thermomixer Eppendorf 05-412-503
HBSS+ Buffer
Amphotericin B Thermo fisher scientific 15290018 2ml
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free Thermo fisher scientific AM9260G 500µl
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106 10ml
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml VWR 45000-456 500ml bottle
HEPES (1 M) Thermo fisher scientific 15630080 5ml
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture Thermo fisher scientific 15640055 5ml
List of antibodies for FACS
Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody BioLegend 369820 1:50
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set Fisher Scientific BDB552843
CD31 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-091-935 20µl/ 107 total cells
CD45 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-045-801 20µl/ 107 total cells
DAPI Sigma Aldrich D9542-10MG 1:10000
FITC anti-human CD235a BioLegend 349104 1:100
FITC anti-human CD31 BioLegend 303104 1:100
FITC anti-human CD45 BioLegend 304054 1:100
FITC anti-mouse IgM Antibody BioLegend 406506 1:500
Mouse IgM anti human HT2-280 Terrace Biotech TB-27AHT2-280 1:300
PE anti-human CD271(NGFR) BioLegend 345106 1:50
Composition of Organoid Culture mediums
MRC-5 ATCC CCL-171
PneumaCult -ALI Medium Stemcell Technologies 5001
Small Airway Epithelial Cell Growth Medium PromoCell C-21170
ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile Greiner Bio-One 662641
Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) Stemcell Technologies 72302
Mouse Basal medium:
Amphotericin B Thermo fisher scientific 15290018 50 µl
DMEM/F-12, HEPES ThermoFisher scientific 11330032 50 ml
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106 5 ml
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) ThermoFisher scientific 41400045 500 µl
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture Thermo fisher scientific 15640055 500 µl
SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) Stem cell 72234 5 µl
List of antibodies for Immunohistochemistry
Antigen unmasking solution, citric acid based Vector H-3300 937 µl in 100ml water
Histogel Thermo Scientific HG-4000-012
Primary Antibodies
Anti HT2-280 Terracebiotech TB-27AHT2-280 1:500
FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) Thermo Fisher Scientific 14-9965-82 1:300
Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody R and D systems MAB4218 1:300
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] Biolegend 905901 1:500
MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) Thermo Fisher Scientific MA5-12178 1:300
PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) LifeSpan Biosciences LS-C143022-100 1:300
Purified Mouse Anti-E-Cadherin BD biosciences 610182 1:1000
Sox-2 Antibody Santa Cruz biotechnologies sc-365964 1:300
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit lgG, 488 Thermo Fisher Scientific A-21206 1:500
FITC anti-mouse IgM Antibody BioLegend 406506 1:500
Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A-21113 1:500
Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21121 1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21131 1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-21134 1:500
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-21144 1:500
Buffers
Immunohistochemistry Blocking Solution 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline)
Immunohistochemistry Incubation Solution 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS
Immunohistochemistry Washing Solution TBS with 0.1% Tween 20
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References

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Keywords: 3D Organoid CultureLung Epithelial Progenitor CellsCell FractionationRegional DifferencesDisease ModelingDrug DiscoveryCell IsolationCell Strainers
check_url/fr/61541?article_type=t

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Citer Cet Article
Konda, B., Mulay, A., Yao, C., Beil, S., Israely, E., Stripp, B. R. Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture. J. Vis. Exp. (161), e61541, doi:10.3791/61541 (2020).
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