ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए मानव फेफड़े उपकला पूर्वज कोशिकाओं का अलगाव और संवर्धन
Summary
यह लेख ऊतक पृथक्करण और सेलुलर विभाजन दृष्टिकोण के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान करता है जो मानव फेफड़ों के समीपस्थ और डिस्टल क्षेत्रों से व्यवहार्य उपकला कोशिकाओं के संवर्धन की अनुमति देता है। इसमें इन दृष्टिकोणों को 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृति मॉडल के उपयोग के माध्यम से फेफड़ों के उपकला पूर्वज कोशिकाओं के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए लागू किया जाता है।
Abstract
उपकला ऑर्गेनोइड मॉडल एक अंग प्रणाली के मूल जीव विज्ञान का अध्ययन करने और रोग मॉडलिंग के लिए मूल्यवान उपकरण के रूप में काम करते हैं। जब ऑर्गेनोइड के रूप में उगाया जाता है, तो उपकला पूर्वज कोशिकाएं स्वयं को नवीनीकृत कर सकती हैं और विभेदक संतान उत्पन्न कर सकती हैं जो विवो समकक्षों के समान सेलुलर कार्यों को प्रदर्शित करती हैं। यहां हम मानव फेफड़ों से क्षेत्र-विशिष्ट पूर्वजों को अलग करने और एक प्रयोगात्मक और सत्यापन उपकरण के रूप में 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम क्षेत्र-विशिष्ट पूर्वज कोशिकाओं को अलग करने के लक्ष्य के साथ फेफड़ों के समीपस्थ और डिस्टल क्षेत्रों को परिभाषित करते हैं। हमने फेफड़ों और श्वासनली से कुल कोशिकाओं को अलग करने के लिए एंजाइमी और यांत्रिक पृथक्करण के संयोजन का उपयोग किया। विशिष्ट पूर्वज कोशिकाओं को तब समीपस्थ या डिस्टल मूल कोशिकाओं से सेल प्रकार-विशिष्ट सतह मार्करों के आधार पर प्रतिदीप्ति संबद्ध सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करके विभाजित किया गया था, जैसे बेसल कोशिकाओं को छांटने के लिए एनजीएफआर और वायुकोशीय प्रकार द्वितीय कोशिकाओं को छांटने के लिए एचटीआईआई -280। पृथक बेसल या वायुकोशीय प्रकार द्वितीय पूर्वजों का उपयोग 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए किया गया था। डिस्टल और समीपस्थ दोनों पूर्वजों ने डिस्टल क्षेत्र में 9-13% और समीपस्थ क्षेत्र में 7-10% की कॉलोनी बनाने वाली दक्षता के साथ ऑर्गेनोइड का गठन किया, जब 30 दिन 5000 सेल / डिस्टल ऑर्गेनोइड्स ने संस्कृति में एचटीआईआई -280+ वायुकोशीय प्रकार द्वितीय कोशिकाओं को बनाए रखा, जबकि समीपस्थ ऑर्गेनोइड 30 दिन तक सिलिएटेड और स्रावी कोशिकाओं में विभेदित हो गए। इन 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों का उपयोग फेफड़ों के उपकला और उपकला मेसेनकाइमल इंटरैक्शन के कोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन करने के साथ-साथ एक बीमारी में उपकला शिथिलता को लक्षित करने वाली चिकित्सीय रणनीतियों के विकास और सत्यापन के लिए एक प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में किया जा सकता है।
Introduction
मानव श्वसन प्रणाली के हवाई क्षेत्रों को मोटे तौर पर संचालन और श्वसन क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है जो क्रमशः उपकला-माइक्रोवास्कुलर बाधा में गैसों के परिवहन और उनके बाद के आदान-प्रदान की मध्यस्थता करते हैं। संचालन वायुमार्ग में श्वासनली, ब्रांकाई, ब्रोंकिओल्स और टर्मिनल ब्रोंकिओल्स शामिल हैं, जबकि श्वसन वायु रिक्त स्थान में श्वसन ब्रोंकिओल्स, वायुकोशीय नलिकाएं और एल्वियोली शामिल हैं। प्रत्येक कार्यात्मक रूप से अलग क्षेत्र की अनूठी आवश्यकताओं को समायोजित करने के लिए इन हवाई क्षेत्रों का उपकला अस्तर प्रॉक्सिमो-डिस्टल अक्ष के साथ संरचना में बदलता है। ट्रेकियो-ब्रोन्कियल वायुमार्ग का छद्म स्तरीकृत उपकला ब्रश, न्यूरोएंडोक्राइन और आयनोसाइट 1,2,3 सहित कम प्रचुर मात्रा में सेल प्रकारों के अलावा तीन प्रमुख सेल प्रकारों, बेसल, स्रावी और सिलिएटेड से बना है। ब्रोंकिओलर वायुमार्ग रूपात्मक रूप से समान उपकला कोशिका प्रकारों को बंद करते हैं, हालांकि उनकी बहुतायत और कार्यात्मक गुणों में भेद हैं। उदाहरण के लिए, बेसल कोशिकाएं ब्रोंकिओलर वायुमार्ग के भीतर कम प्रचुर मात्रा में होती हैं, और स्रावी कोशिकाओं में क्लब कोशिकाओं बनाम सीरस और गोबलेट कोशिकाओं का एक बड़ा अनुपात शामिल होता है जो ट्रेकियो-ब्रोन्कियल वायुमार्ग में प्रबल होते हैं। श्वसन क्षेत्र की उपकला कोशिकाओं में वायुकोशीय प्रकार I (ATI) और वायुकोशीय नलिकाओं और एल्वियोली 1,4 के प्रकार II (एटीआईआई) कोशिकाओं के अलावा श्वसनब्रोंकिओल्स में एक खराब परिभाषित घनाभ कोशिका प्रकार शामिल है।
उपकला स्टेम और पूर्वज सेल प्रकारों की पहचान जो प्रत्येक क्षेत्र में उपकला के रखरखाव और नवीकरण में योगदान करती है, अपूर्ण रूप से वर्णित है और बड़े पैमाने पर पशु मॉडल 5,6,7,8 में अध्ययन से अनुमान लगाया गया है। चूहों में अध्ययन से पता चला है कि या तो छद्म स्तरीकृत वायुमार्ग की बेसल कोशिकाएं, या ब्रोंकिओलर वायुमार्ग की क्लब कोशिकाएं या वायुकोशीय उपकला की एटीआईआई कोशिकाएं, असीमित आत्म-नवीकरण और मल्टीपोटेंट भेदभाव 7,9,10,11,12 की क्षमता के आधार पर उपकला स्टेम कोशिकाओं के रूप में काम करती हैं . मानव फेफड़ों के उपकला कोशिका प्रकारों की स्टेमनेस का आकलन करने के लिए आनुवंशिक वंश अनुरेखण अध्ययन करने में असमर्थता के बावजूद, उपकला स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं की कार्यात्मक क्षमता का आकलन करने के लिए ऑर्गेनोइड-आधारित संस्कृति मॉडल की उपलब्धता माउस और मानव 13,14,15,16,17 के बीच तुलनात्मक अध्ययन के लिए एक उपकरण प्रदान करती है।
हम क्षेत्रीय सेल प्रकारों को पुन: प्राप्त करने के लिए 3 डी ऑर्गेनोइड सिस्टम का उपयोग करके मानव फेफड़ों और उनकी संस्कृति के विभिन्न क्षेत्रों से उपकला कोशिका प्रकारों के अलगाव के तरीकों का वर्णन करते हैं। इसी तरह के तरीकों को अन्य अंग प्रणालियों 18,19,20,21 से उपकला कोशिकाओं के कार्यात्मक विश्लेषण और रोग मॉडलिंग के लिए विकसित किया गया है। ये विधियां क्षेत्रीय उपकला पूर्वज कोशिकाओं की पहचान के लिए एक मंच प्रदान करती हैं, उनके विनियमन और सूक्ष्म वातावरण की जांच करने वाले यंत्रवत अध्ययन करने के लिए, और रोग मॉडलिंग और दवा की खोज को सक्षम करने के लिए। भले ही पशु मॉडल में किए गए फेफड़ों के उपकला पूर्वज कोशिकाओं के अध्ययन से विश्लेषण से लाभ हो सकता है, या तो विवो या इन विट्रो में, मानव फेफड़ों के उपकला पूर्वज कोशिकाओं की पहचान में अंतर्दृष्टि काफी हद तक मॉडल जीवों से एक्सट्रपलेशन पर निर्भर रही है। पूर्वज कोशिकाओं के विनियमन की जांच करने वाले अपने अध्ययन के साथ मानव फेफड़ों के उपकला कोशिका प्रकारों की पहचान और व्यवहार से संबंधित एक पुल प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम आणविक या कार्यात्मक विश्लेषण और रोग मॉडलिंग के लिए मानव फेफड़ों के ऊतकों से फेफड़ों की कोशिकाओं की परिभाषित उप-आबादी के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन करते हैं। विधियों के महत्वपूर्ण तत्व?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आईएफसी और एच और ई धुंधला के लिए मिज़ुनो ताकाको, ऊतक सेक्शनिंग के लिए वैनेसा गार्सिया और पांडुलिपि तैयार करने में मदद करने के लिए अनिका एस चंद्रशेखरन से समर्थन की सराहना करते हैं। यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (5आरओ 1 एचएल 135163-04, पीओ 1 एचएल 108793-08) और सेल्जीन आदर्श कंसोर्टियम द्वारा समर्थित है।
Materials
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 | ||
References
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