Isolering og anrikning av humane lungeepiteliale stamceller for organoidkultur
Summary
Denne artikkelen gir en detaljert metodikk for vevsdissosiasjon og cellulære fraksjoneringsmetoder som tillater anrikning av levedyktige epitelceller fra proksimale og distale regioner i den humane lungen. Her brukes disse tilnærmingene for funksjonell analyse av lungeepiteliale stamceller ved bruk av 3D-organoidkulturmodeller.
Abstract
Epitelorganoidmodeller tjener som verdifulle verktøy for å studere den grunnleggende biologien til et organsystem og for sykdomsmodellering. Når de vokser som organoider, kan epiteliale stamceller selvfornye og generere differensierende avkom som utviser cellulære funksjoner som ligner på deres in vivo-kolleger . Her beskriver vi en trinnvis protokoll for å isolere regionspesifikke forfedre fra menneskelig lunge og generere 3D-organoidkulturer som et eksperimentelt og valideringsverktøy. Vi definerer proksimale og distale regioner i lungen med mål om å isolere regionspesifikke stamceller. Vi benyttet en kombinasjon av enzymatisk og mekanisk dissosiasjon for å isolere totalceller fra lunge og luftrør. Spesifikke stamceller ble deretter fraksjonert fra proksimale eller distale opprinnelsesceller ved bruk av fluorescensassosiert cellesortering (FACS) basert på celletypespesifikke overflatemarkører, for eksempel NGFR for sortering av basalceller og HTII-280 for sortering av alveolære type II-celler. Isolerte basale eller alveolære type II-forfedre ble brukt til å generere 3D-organoidkulturer. Både distale og proksimale stamceller dannet organoider med en kolonidannende virkningsgrad på 9-13 % i distale regioner og 7-10 % i proksimal region når de ble belagt med 5000 celler/brønner på dag 30. Distale organoider opprettholdt HTII-280+ alveolære type II-celler i kultur, mens proksimale organoider differensierte til cilierte og sekretoriske celler innen dag 30. Disse 3D-organoidkulturene kan brukes som et eksperimentelt verktøy for å studere cellebiologien til lungeepitel og epiteliale mesenkymale interaksjoner, samt for utvikling og validering av terapeutiske strategier rettet mot epiteldysfunksjon i en sykdom.
Introduction
Luftrom i det humane luftveiene kan grovt deles inn i ledende og respiratoriske soner som formidler transport av gasser og deres påfølgende utveksling over henholdsvis epitel-mikrovaskulær barriere. De ledende luftveiene inkluderer luftrør, bronkier, bronkioler og terminale bronkioler, mens respiratoriske luftrom inkluderer respiratoriske bronkioler, alveolære kanaler og alveoler. Epitelforingen av disse luftrommene endres i sammensetningen langs proximo-distalaksen for å imøtekomme de unike kravene til hver funksjonelt distinkte sone. Det pseudostratifiserte epitelet i trakeo-bronkiale luftveier består av tre hovedcelletyper, basal, sekretorisk og ciliert, i tillegg til de mindre tallrike celletypene, inkludert børste, nevroendokrin og ionocyt 1,2,3. Bronkiolære luftveier har morfologisk lignende epitelcelletyper, selv om det er forskjeller i deres overflod og funksjonelle egenskaper. For eksempel er basalceller mindre rikelig i bronkiolære luftveier, og sekretoriske celler inkluderer en større andel klubbceller versus serøse og begerceller som dominerer i trakeo-bronkiale luftveier. Epitelceller i respiratorisk sone inkluderer en dårlig definert kuboidal celletype i respiratoriske bronkioler, i tillegg til alveolære type I (ATI) og type II (ATII) celler av alveolære kanaler og alveoler 1,4.
Identiteten til epitelstamme og stamcelletyper som bidrar til vedlikehold og fornyelse av epitel i hver sone er ufullstendig beskrevet og i stor grad utledet fra studier i dyremodeller 5,6,7,8. Studier på mus har vist at enten basalceller i pseudostratifiserte luftveier, eller klubbceller i bronkiolære luftveier eller ATII-celler i det alveolære epitelepitelet, tjener som epitelstamceller basert på kapasitet for ubegrenset selvfornyelse og multipotent differensiering 7,9,10,11,12 . Til tross for manglende evne til å utføre genetiske avstamningssporingsstudier for å vurdere stamme av humane lungeepitelcelletyper, gir tilgjengeligheten av organoidbaserte kulturmodeller for å vurdere det funksjonelle potensialet til epitelstamme- og stamceller et verktøy for komparative studier mellom mus og menneske 13,14,15,16,17.
Vi beskriver metoder for isolering av epitelcelletyper fra forskjellige regioner i den menneskelige lungen og deres kultur ved hjelp av et 3D-organoid system for å rekapitulere de regionale celletypene. Lignende metoder er utviklet for funksjonsanalyse og sykdomsmodellering av epitelceller fra andre organsystemer 18,19,20,21. Disse metodene gir en plattform for identifisering av regionale epiteliale stamceller, for å utføre mekanistiske studier som undersøker regulering og mikromiljø, og for å muliggjøre sykdomsmodellering og narkotikaforskning. Selv om studier av lungeepiteliale stamceller utført i dyremodeller kan dra nytte av analysen, enten in vivo eller in vitro, har innsikt i identiteten til humane lungeepitelceller i stor grad vært avhengig av ekstrapolering fra modellorganismer. Som sådan gir disse metodene en bro for å forholde seg til identiteten og oppførselen til humane lungeepitelcelletyper med sine studier som undersøker regulering av stamceller / stamceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en pålitelig metode for isolering av definerte subpopulasjoner av lungeceller fra humant lungevev for enten molekylær eller funksjonell analyse og sykdomsmodellering. Kritiske elementer i metoder inkluderer evnen til å oppnå vevsdissosiasjon med bevaring av overflateepiteler, som tillater antistoffmediert anrikning av ferskt isolerte celler, og optimalisering av kulturmetoder for effektiv generering av regionspesifikke epitelorganoider. Vi fokuserer på utvinning og anrikning av epiteliale stamceller som…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi setter pris på støtte fra Mizuno Takako for IFC- og H- og E-farging, Vanessa Garcia for vevssnitt og Anika S Chandrasekaran for å hjelpe til med manuskriptforberedelse. Dette arbeidet støttes av National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) og Celgene IDEAL Consortium.
Materials
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 | ||
References
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
- Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
- Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050 (2008).
- McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
- Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Weber, C. Organoids test drug response. Nature Cell Biology. 20 (6), 634 (2018).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
- Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
- Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).
