Præsenteret her er en analyse for at kvantificere somatisk hypermutation inden for immunoglobulin tunge kæde gen locus ved hjælp af germinal center B-celler fra musen Peyer’s patches.
Inden for germinale centre af lymfoide organer ændrer modne B-celler deres udtrykte immunoglobulin (Ig) ved at indføre umådelige mutationer i de variable kodningsekoner af Ig tunge og lette kædegen loci. Denne proces med somatisk hypermutation (SHM) kræver enzymet aktiveringsinduceret cytidin deaminase (AID), som omdanner deoxycytidiner (C), til deoxyuridiner (U). Behandling af AID-genererede U: G mismatches i mutationer ved basen excision og mismatch reparation veje introducerer nye Ig kodning sekvenser, der kan producere en højere affinitet Ig. Mutationer i AID eller DNA reparation gener kan blokere eller væsentligt ændre de typer af mutationer observeret i Ig loci. Vi beskriver en protokol til at kvantificere JH4 intronmutationer, der bruger fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), PCR og Sanger sekventering. Selv om denne analyse ikke direkte måle Ig affinitet modning, det er tegn på mutationer i Ig variabel kodning sekvenser. Derudover anvender disse metoder almindelige molekylærbiologiske teknikker, der analyserer mutationer i Ig-sekvenser af flere B-cellekloner. Således er denne analyse et uvurderligt værktøj i undersøgelsen af SHM og Ig diversificering.
B-celler, medlemmer af det adaptive immunsystem, genkender og eliminerer antigener ved at producere antistoffer, også kendt som immunoglobuliner (Ig). Hver Ig består af to tunge (IgH) og to lette (IgL) kæde polypeptider, som holdes sammen af disulfidbindinger for at danne den karakteristiske “Y” formstruktur af Ig1. N-termini af IgH og IgL omfatter variabel (V) region af hver polypeptid og tilsammen udgør de antigen bindende sted for Ig, mens den konstante region IgH bibringer effector funktion Ig. Udvikling af B-celler i knoglemarven omarrangerer V-kodnings exons af IgH og IgL i en proces, der kaldes V(D)J rekombination2,3,4. Transskription af de rekombinerede V exons, kombineret med de respektive konstante region exons, danner mRNA, der er oversat til Ig.
Modne B-celler, der udtrykker en membranbundet Ig, også kendt som en B-cellereceptor (BCR), cirkulerer til sekundære lymfoide organer, såsom milt, lymfeknude eller Peyers pletter, hvor de undersøger miljøet for antigener og interagerer med andre celler i immunsystemet1. Inden for germinale centre (GC) af sekundære lymfoide organer, B-celler, der genkender antigen gennem BCR bliver aktiveret. Hjulpet af follikulære dendritiske celler og follikulær hjælper T-celler kan aktiverede B-celler derefter formere sig og differentiere sig til plasma- og hukommelsesceller, som er vigtige effektorer af et robust immunrespons5,6,7,8,9. Derudover kan disse aktiverede B-celler gennemgå sekundære Ig-gendiversificeringsprocesser – klassekontakt rekombination (CSR) og somatisk hypermutation (SHM). Under CSR udveksler B-celler standard μ konstant region i IgH-polypeptid med en anden konstant region (γ, α ε) gennem en DNA-deletional-rekombinationsreaktion (Figur 1). Dette giver mulighed for at udtrykke en anden konstant exon og oversættelse af et nyt Ig. B-cellen skifter fra at udtrykke IgM til en anden isotype (IgG, IgA, IgE). CSR ændrer Ig’s virknings- eller funktion uden at ændre dens antigenspecifikitet10,11,12. Under SHM muterer B-cellerne imidlertid V-kodningsregionerne IgH og IgL for at muliggøre produktion og udvælgelse af højere affinitetS-IGS, hvilket mere effektivt kan eliminere et antigen13,14,15 ( Figur1). Det er vigtigt, at både CSR og SHM afhænger af et enzym: aktiveringsinduceret cytidindeaminase (AID)16,17,18. Mennesker og mus mangelfuld i AID kan ikke fuldføre CSR eller SHM og til stede med forhøjede IgM serum titers eller Hyper-IgM17,19.
I CSR deaminerer AID deoxycytidiner (C) i de gentagne switchområder, der går forud for hver konstant kodningseknuder, omdanner dem til deoxyuridiner (U)20,21, hvilket skaber uoverensstemmende basisparring mellem deoxyuridiner og deoxyguanosiner (U:G). Disse U:G-uoverensstemmelser omdannes til dobbeltstrengede DNA-pauser, som er nødvendige for DNA-rekombination, enten ved reparation af basis excision (BER) eller Uoverensstemmelsesreparation (MMR) vej22,23,24,25,26,27,28,29. I SHM deaminerer AID C inden for V-kodnings exons. Replikation på tværs af U:G-mismatchet genererer C:G til T:A-overgangsmutationer, mens fjernelse af uracilbasen af BER-proteinet, uracil DNA glycosylase (UNG), før DNA-replikation producerer både overgangs- og transversionsmutationer16. Null-mutationer i UNG øger C:G til T:A-overgangsmutationer21,22betydeligt . I lighed med CSR kræver SHM MFR’s og BER’s komplementære roller. Under SHM genererer MFR mutationer ved A:T basepar. Inaktivering af mutationer i MutS homologi 2 (MSH2) eller DNA polymerase η (Polη) reducerer mutationer på A:T baser og sammensatte mutationer i MSH2 og Polη næsten afskaffer mutationer på A:T baser21,30,31. I overensstemmelse med den kritiske rolle, som BER og MFR spiller i konverteringen af AID-genereret U til overgangs- eller transversionsmutationer, viser mus, der mangler for både MSH2 og UNG (MSH2-/-UNG-/-), kun C:G til T:A-overgangsmutationer som følge af replikation på tværs af U:G mismatch21.
Analysen af SHM i V-kodningsområder er fortsat kompliceret,fordi udvikling af B-celler kan rekombinere en hvilken som helst af V(D)J-kodnings exons i IgH og IgL loci1,2,4. Nøjagtig analyse af disse unikt rekombinerede og somatically muterede V-områder kræver identifikation og isolering af kloner af B-celler eller Ig mRNA11,13. Den JH4 intron, som er 3 ‘af de sidste J kodning exon i IgH locus, havne somatiske mutationer på grund af spredning af mutationer 3 ‘af V promotor32,33,34 og derfor ofte bruges som en surrogat markør for SHM i V regioner31,35 ( Figur1). For eksperimentelt at belyse, hvordan specifikke gener eller genetiske mutationer ændrer SHM-mønstre eller -satser, kan JH4-intronen sekventeres fra Peyers patches (PP) germinale center B-celler (GCBCs), som gennemgår høje SHM36,37,38. GCBCs kan let identificeres og isoleres med fluorescerende konjugerede antistoffer mod celleoverflademarkører (B220+PNAHI)17,39.
En detaljeret protokol præsenteres for at karakterisere JH4 intronmutationer i PP GCBCs fra mus ved hjælp af en kombination af FACS (fluorescensaktiveret cellesortering), PCR og Sanger sekventering (Figur 2).
Karakterisere SHM inden for IgH og IgL V kodning sekvenser af en heterogen B celle befolkning udgør en udfordring, da hver B-celle entydigt reorganiserer V kodning segmenter under V (D) J rekombination34. I dette papir beskriver vi en metode til at identificere mutationer i JH4 intron af GCBCs. JH4-intronen, der er placeret 3′ af det sidste J-kodningssegment i IgH-locus, bruges som surrogat for SHM i V-regioner (Figur 1)31,33,34,35. For at katalogisere disse JH4 intronmutationer og vurdere, hvordan specifikke gener påvirker produktionen eller mønsteret af mutationer, analyseres PP GCBCs specifikt. Disse celler akkumulerer JH4 intronmutationer som følge af kronisk stimulation ved tarmmikrobiota53. Desuden B220+PNAHI GCBCs fra PC’er af unimmunized mus har en mutation spektre, der sammenligner med milt GCBCs fra immuniserede dyr54,55. Mutationer i JH4-intronen kan imidlertid ikke korreleres med Ig-affinitetsmodning, fordi disse mutationer ikke er kodning.
For at afgøre, om SHM ændrer Ig affinitet, mus bør immuniseres intraperitoneally med et antigen, såsom NP (4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl) konjugeret til CGG (kylling gamma globulin) eller KLH (nøglehullet limpet hemocyanin)56. Derefter kan mRNA renses fra milt B220+PNAHI GCBCs for at undersøge SHM inden for VH186.2, V-kodning exon, der oftest genkender NP og muteres efter NP-CGG eller NP-KLH immunisering31,57,58,59,60. Mutation af tryptophan-33 til en leucin i VH186,2 er blevet karakteriseret for at øge Ig affinitet op til 10 gange59,60 og er derfor en indikator for, at SHM og klonvalg har genereret høj affinitet Ig. Måling af NP7- og NP20-specifikke serum Ig titers ved ELISA og beregning af det Ig-specifikke NP7/NP20-forhold i løbet af immuniseringen dokumenterer også Ig affinitetsmodning som følge af SHM i V-regioner17,21,36. Begge disse assays kan bruges til at korrelere SHM inden for VH186,2 kodning sekvenser med ændringer i NP-specifikke Ig affinitet modning.
Uanset om immuniserede eller ikke-immuniserede dyr bruges til at analysere SHM af VH186.2 eller JH4 intron, skal GCBCs identificeres nøjagtigt. Vi præsenterer en FACS baseret tilgang til at isolere B220+PNAHI GCBCs. Alternativt kan Fas og ikke-sulfatt α2-6-sialyl-LacNAc antigen, som er anerkendt af GL7 antistof61,62,63,64, også bruges til at isolere GCBCs, som er identificeret som B220+Fas+GL7+65 eller CD19+Fas+GL7+37. GL7-udtryk afspejler PNA i aktiverede GCBCs af lymfeknuderne64,65,66. Ud over at anvende antistofmarkører, der er specifikke for GCBCs, bør farvning af cocktails maksimere udskillelsen af en fluorophore og påvisning af en biomarkør, samtidig med at spektral overlapning af fluorescensemission minimeres. Antigener udtrykt ved lave niveauer bør påvises med et antistof, der er konjugeret til en fluorophore med en robust emissionsfluorescens67. Den anbefalede farvningsprotokol blev optimeret til analyse på en cellesortering udstyret med fire lasere (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) og 12 filtre; Filterkonfigurationer og lasertilgængelighed varierer dog mellem cytometre. For at ændre protokollen i henhold til reagens og udstyr tilgængelighed, læseren henvises til yderligere ressourcer, online spektrum seere og offentliggjort litteratur67,68,69,70,71,72,73. Den multifarvede farvningsprotokol, der er beskrevet heri, kræver kompensation for spektral overlapning for at sikre, at de sorterede cellepopulationer er GCBCs snarere end unøjagtig påvisning af fluorescensemission. B220 fungerer som en nyttig farvningskontrol for de beskrevne FACS (tabel 1B), fordi pc’er vil have en karakteristisk B220-negativ og positiv population (figur 3C), som giver mulighed for passende kompensation for spektral overlapning. Den gatingstrategi, der præsenteres i figur 3C, bør anvendes som retningslinje. Strømningscytometriområderne kan variere afhængigt af farvningsbetingelserne og cytometerindstillingerne. Ikke desto mindre bør 4-10% af de levende celler være B220+PNAHI 35, 52.
Alle mutationer inden for JH4 intron af PP GCBCs skal valideres for at sikre, at de observerede mutationer er virkelig afspejler SHM og ikke en artefakt af PCR eller sekventering. AID-/- B-celler kan tjene som en nyttig negativ kontrol ved undersøgelse af SHM-fænotypen i andre mutantmusmodeller, fordi disse celler ikke kan fuldføre SHM17,19. JH4 intronmutationshastigheden i AID-/- GCBCs (1.66×10-5 mutationer/bp)20,21,36,37,38,50,74 kan sammenlignes med fejlprocenten for high fidelity polymerase (5.3×10-7 sub/base/fordobling)51,52, der bruges til at forstærke DNA’et i den indlejrede PCR. Hvis AID-/- mus ikke er tilgængelige, skal du sammenligne det observerede mutationsmønster og hyppighed med den publicerede litteratur. Ig V-regioner akkumulerer 10-3-10-4 mutationer pr. basepardivision, hvilket er ca. 106gange højere end mutationshastigheden for andre gen loci73,75. Resultaterne kan variere afhængigt af dyrets alder76. Alternativt kan B220+PNA LO-celler, der markerer ikke-GCBCs, anvendes som en negativ kontrol, hvis der ikke er TALE OM STØTTE-/- mus 52. Hvis mutationsfrekvensen i WT GCBCs er lavere end forventet, kan WT-kimlinjen JH4 intronic-sekvensen være uforholdsmæssigt repræsenteret. I dette tilfælde skal du sikre dig, at GCBC’er blev farves og sorteres korrekt, og PCR’er er fri for WT-kimlinje JH4 intronforurening. Derudover bør rå sekventeringsdata i elektrofeerogrammer analyseres grundigt for at sikre, at mutationer i sekvenstekstdataene ikke er artefakter af sekventeringsfejl. Dårlige Sanger-sekventeringsresultater kanf.eks. Denne kvalitetskontrol af Sanger sekvensdata vil øge nøjagtigheden og reproducerbarheden af JH4 intronmutationsanalysen.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Tasuku Honjo for AID-/- mus. Dette arbejde blev støttet af The National Institute on Minority Health and Health Disparities (5G12MD007603), The National Cancer Institute (2U54CA132378) og The National Institute of General Medical Sciences (1SC1GM132035-01).
0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed | USA Scientific | 1402-4708 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | BP1760-5 | |
APC-eFluor780 anti-CD45R/B220 | eBioscience | 47-0452-80 | clone RA3-6B2 |
BD FACSAria II | BD | 643186 | four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50), AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40), PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60)) |
BD slip tip 1mL syringe | Fisher | 14-823-434 | sterile |
Biotinylated peanut agglutinin (PNA) | Vector Labs | B-1075-5 | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap | Fisher | 08-771-23 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride) | Fisher | D1306 | 0.5 mg/ml |
dNTP | NEB | N0447L | 10 mM |
ElectroMAX DH10B competent cells | Fisher | 18-290-015 | |
Falcon cell strainer 40mm | Fisher | 08-771-1 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes) | Fisher | 14-959-5 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped) | Fisher | 149591A | |
Fetal bovine serum | R&D Systems (Atlanta Biologicals) | S11150 | |
Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4 | Fisher | 10-010-049 | |
Glycogen | Sigma | 10901393001 | |
Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro) | DNA Star | version 15 | |
PE anti-CD45R/B220 | BD | 553090 | clone RA3-6B2 |
Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0491L | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate | eBioscience | 47-4317-82 | |
T4 DNA ligase | NEB | M020L | |
Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit | ThermoFisher | FERK1231 | |
Tissue culture plate 6 well | Fisher | 08-772-1B | sterile |
Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD | Fisher | BDB553142 | Clone 2.4G2 |