Functional Assessment of <em>BRCA1</em> variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Ji-Eun See; Ha Rim Shin; Gayoung Jang; Jiyeon Kweon; Yongsub Kim

doi:10.3791/61557

JoVE Journal > Cancer Research

Recherche en cancérologie

Funksjonell vurdering av BRCA1-varianter ved hjelp av CRISPR-Medierte baseredigerere

Published: February 28, 2021

doi:

10.3791/61557

Ji-Eun See², Ha Rim Shin², Gayoung Jang², Jiyeon Kweon², Yongsub Kim²

¹Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center,University of Ulsan College of Medicine, ²Stem Cell Immunomodulation Research Center,University of Ulsan College of Medicine

Summary

Personer med BRCA1 mutasjoner har en høyere risiko for å utvikle kreft, noe som garanterer nøyaktig evaluering av funksjonen til BRCA1-varianter. Her beskrev vi en protokoll for funksjonell vurdering av BRCA1-varianter ved hjelp av CRISPR-medierte cytosinbaseredigerere som muliggjør målrettet C:G til T:A konvertering i levende celler.

Abstract

Nyere studier har undersøkt risikoen forbundet med BRCA1 genmutasjoner ved hjelp av ulike funksjonelle vurderingsmetoder som fluorescerende reporteranalyser, embryonale stamcellevariasjonsanalyser og terapeutiske legemiddelbaserte sensitivitetsanalyser. Selv om de har avklart mange BRCA1-varianter, er disse analysene som involverer bruk av eksogent uttrykte BRCA1-varianter forbundet med overuttrykksproblemer og kan ikke brukes på post-transkripsjonsregulering. For å løse disse begrensningene har vi tidligere rapportert en metode for funksjonell analyse av BRCA1-varianter via CRISPR-mediert cytosinbaseredigerer som induserer målrettet nukleotidsubstitusjon i levende celler. Ved hjelp av denne metoden identifiserte vi varianter hvis funksjoner forblir tvetydige, inkludert c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T og c.4986+5G>A, og bekreftet at CRISPR-medierte baseredigerere er nyttige verktøy for å reklassifisere variantene av usikker betydning i BRCA1. Her beskriver vi en protokoll for funksjonell analyse av BRCA1-varianter ved hjelp av CRISPR-basert cytosinbaseredaktør. Denne protokollen inneholder retningslinjer for valg av målområder, funksjonell analyse og evaluering av BRCA1-varianter.

Introduction

Brystkreft type 1 følsomhet genet (BRCA1) er en allment kjent tumor suppressor genet. Fordi BRCA1-genet er relatert til reparasjon av DNA-skader, vil mutasjoner i dette genet føre til en større risiko for kreftutvikling hos en individuell¹. Brystkreft, ovariekreft, prostata og bukspyttkjertelkreft er knyttet til arvelige funksjonstap (LOF) mutasjoner av BRCA1 ^{genet 2}. Funksjonell vurdering og identifisering av BRCA1-varianter kan bidra til å forebygge og diagnostisere de ulike sykdommene. For å adressere funksjonen til BRCA1-varianter er det utviklet flere metoder for å undersøke patogeniteten til BRCA1-varianter som embryonale stamcellevariasjonsanalyser, fluorescerende reporteranalyser og terapeutiske legemiddelbaserte følsomhetsanalyser^3,^4,^5,⁶. Selv om disse metodene har vurdert funksjonen til mange BRCA1-varianter, utgjør metodene som involverer eksogent uttrykt BRCA1-varianter begrensninger når det gjelder overuttrykk som kan påvirke nedstrømsregulering, gendosering og proteinfolding⁷. Videre kan disse analysene ikke utnyttes til posttranscriptional regulering som mRNA spleising, transkripsjon stabilitet, og effekten av uoversettet region⁸^,⁹.

CRISPR-Cas9-systemet muliggjør målrettet genomredigering i levende celler og^{organismer 10}. Gjennom en enkeltguide RNA, Cas9 kan indusere dobbel-strand pauser (DSBs) i kromosomalt DNA på bestemte genomisk loci for å aktivere to DNA reparasjonsveier: feilutsatt nonhomologous end-joining (NHEJ) pathway og feilfri homologi-rettet reparasjon (HDR) sti¹¹. HDR er en presis reparasjonsmekanisme; DSBs indusert av Cas9-kjerner for HDR resulterer imidlertid ofte i uønsket innsetting og sletting (indel) mutasjon. I tillegg trenger den homologe donor DNA-maler for å reparere DNA-skader og har relativt lav effektivitet. Nylig har Cas9 nickase (nCas9) blitt smeltet sammen med cytidindeaminasedomener for målretting av C:G til T:A-erstatninger, uten behov for homologe DNA-maler og DNA-dobbelttrådbryter^12,^13,^14,¹⁵. Ved hjelp av cytosinbaseredaktøren utviklet vi en ny metode for funksjonell analyse av BRCA1-varianter¹⁶.

I denne studien brukte vi CRISPR-mediert cytosinbaseredaktør, BE3¹⁴, som induserer effektive C:G til T:A punktmutasjoner, for å implementere den funksjonelle vurderingen av BRCA1-varianter og vellykket identifisert funksjonene til flere BRCA1-varianter (figur 1).

Figur 1: En oversikt over arbeidsflyten for funksjonell vurdering. (A) Skjematisk viser funksjonell vurdering av BRCA1. Fordi LOF av BRCA1 påvirker celle levedyktighet, når BRCA1 mutasjonen er patogen, cellene dør som passasjen tallet øker. (B) Stadier av funksjonsvurderingen av BRCA1. Stiplet boks er valgfritt. Det kan erstattes ved samtidig transfection av gRNA uttrykker og BE3 uttrykker plasmider DNA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Merk: Metode 1 (generering av HAP1-BE3-cellelinjer) er valgfritt. I stedet for å konstruere en BE3-uttrykkende cellelinje, kan BE3-koding av plasmid-DNA bli samtidig transfisert med gRNA-koding plasmid DNA. Andre varianter av cytosinbaseredaktører, for eksempel BE4max, kan også brukes til svært effektiv baseredigering. 1. Generering av HAP1-BE3 cellelinjer Bygging av plasmid DNA For å konstruere lentiBE3-blast plasmid DNA for lentivirusproduksjon, forsterke BE3 koding se…

Representative Results

De eksperimentelle tilnærmingene som er beskrevet i denne protokollen, muliggjør funksjonell vurdering av endogene BRCA1-varianter generert av CRISPR-baserte cytosinbaseredaktører. For å velge passende cellelinjer for funksjonell vurdering av BRCA1-varianter, bør forskerne bekrefte at BRCA1 er viktig gen i de målrettede cellelinjene. For eksempel transfiserte vi først Cas9 og gRNAer i HAP1-cellelinjer for å forstyrre BRCA1 og analyserte mutasjonsfrekvenser ved målrettet dyp se…

Discussion

Denne protokollen beskriver en enkel metode for funksjonelle vurderinger av BRCA1-varianter ved hjelp av CRISPR-meditert cytosinbaseredigerer. Protokollen beskriver metoder for utforming av gRNAs på mållocus og bygging av plasmid DNAs som de uttrykkes fra. Cytosinbaseredaktører induserer nukleotidkonvertering i et aktivt vindu (i tilfelle BE3, nukleotider 4–8 i PAM-distale enden av gRNA-målsekvensene). Forskeren bør nøye velge målsekvenser fordi alle cytosiner i aktivt vindu kan erstattes med thyminer. …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation of Korea (tilskudd 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 og 2018R1A5A2020732 til Y.K.).

Materials

BamHI	NEB	R3136	Restriction enzyme
Blasticidin	Thermo Fisher Scientific	A1113903	Drug for selecting transduced cells
BsaI	NEB	R0535	Restriction enzyme
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504	Genomic DNA prep. kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Gibco	11965092	Medium for HEK293T/17 cells
Fetal bovine serum	Gibco	16000036	Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311	Transfection reagent
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611L	Gibson assembly kit
Iscove’s modified Dulbecco’s medium	Gibco	12440046	Medium for HAP1 cells
lentiCas9-Blast	Addgene	52962	Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027	Transfection reagent
Opti-MEM	Gibco	31985070	Transfection materials
pCMV-BE3	Addgene	73021	Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140	Supplemetal for cell culture
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530SQ	High-fidelity polymerase
pMD2.G	Addgene	12259	Plasmids DNA for virus prep.
pRG2	Addgene	104174	gRNA cloning vector
psPAX2	Addgene	12260	Plasmids DNA for virus prep.
QIAprep Spin Miniprep kit	Qiagen	27106	Plasmid DNA prep. Kit
QIAquick Gel extraction Kit	Qiagen	28704	Gel extraction kit
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	PCR product prep. kit
Quick Ligation Kit	NEB	M2200	Ligase for gRNA cloning
T7 Endonuclease I	NEB	M0302	Materials for T7E1 assay
XbaI	NEB	R0145	Restriction enzyme

References

Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).
Millot, G. A., et al. A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance. Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).
Santos, C., et al. Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).
Starita, L. M., et al. A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function. American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).
Anantha, R. W., et al. Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance. Elife. 6, (2017).
Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs. Frontiers in Genetics. 6, 242 (2015).
Saunus, J. M., et al. Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR. Recherche en cancérologie. 68 (22), 9469-9478 (2008).
Knott1, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361, 866-869 (2018).
Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
Hess, G. T., et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).
Kim, K., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).
Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
Park, D. S., et al. Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos. Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).
Kweon, J., et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).
Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
Findlay, G. M., et al. Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).
Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries. PLoS One. 13 (6), 0199473 (2018).
Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).
Sayers, E. W., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 47 (1), 94-99 (2019).
Hwang, G. H., et al. Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing. BMC Bioinformatics. 19 (1), 542 (2018).
Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).
Clement, K., et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).
Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. , (2020).
Kim, D., et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).
Zuo, E., et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 364 (6437), 289-292 (2019).
Jin, S., et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 364 (6437), 292-295 (2019).
Grunewald, J., et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).
Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).
Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

See, J., Shin, H. R., Jang, G., Kweon, J., Kim, Y. Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors. J. Vis. Exp. (168), e61557, doi:10.3791/61557 (2021).