आंतरिक रूप से अस्त-व्यस्त डोमेन ऑन्कोजेनिक फ्यूजन ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन प्रोटीनों को चिकित्सीय रूप से लक्षित करने के लिए, इन डोमेन द्वारा नियोजित नियामक तंत्रों की अधिक विस्तृत समझ की आवश्यकता है। यहां, हम ईविंग सारकोमा में आंतरिक रूप से अव्यवस्थित ईडब्ल्यूएस डोमेन की महत्वपूर्ण संरचनात्मक विशेषताओं को मैप करने के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक्स का उपयोग करते हैं।
कई कैंसर गुणसूत्र ट्रांसलोकेशन की विशेषता है जिसके परिणामस्वरूप ऑन्कोजेनिक फ्यूजन ट्रांसक्रिप्शन कारकों की अभिव्यक्ति होती है। आमतौर पर, इन प्रोटीनों में एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित डोमेन (IDD) होता है जो किसी अन्य प्रोटीन के डीएनए-बाध्यकारी डोमेन (डीबीडी) के साथ जुड़ा हुआ होता है और द्रोह को बढ़ावा देने के लिए व्यापक प्रतिलेखन परिवर्तन आर्केस्ट्रा करता है। ये संलयन अक्सर उनके कारण होने वाले कैंसर में एकमात्र आवर्ती जीनोमिक विचलन होते हैं, जिससे वे आकर्षक चिकित्सीय लक्ष्य बन जाते हैं। हालांकि, ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों को लक्षित करने के लिए मशीनी भूमिका की बेहतर समझ की आवश्यकता होती है जो कम जटिलता, IDDs अपने कार्य में खेलते हैं। ईडब्ल्यूएसआर1 का एन-टर्मिनल डोमेन ईडब्ल्यूएस/एफएलआई, ईडब्ल्यूएस/एटीएफ और ईडब्ल्यूएस/डब्ल्यूटी1 सहित विभिन्न प्रकार के ऑन्कोजेनिक फ्यूजन ट्रांसक्रिप्शन कारकों में शामिल एक आइडी है । यहां, हम ईविंग सारकोमा में ईडब्ल्यूएस/फ्लाई के प्रतिलेखन कार्य के लिए महत्वपूर्ण ईडब्ल्यूएस डोमेन की संरचनात्मक विशेषताओं की जांच करने के लिए आरएनए-अनुक्रमण का उपयोग करते हैं। ईविंग सारकोमा कोशिकाओं से अंतर्जात संलयन की पहली shRNA-मध्यस्थता कमी ईडब्ल्यूएस-उत्परिवर्ती निर्माण की एक किस्म की एक्टोपिक अभिव्यक्ति के साथ बनती है। फिर आरएनए-अनुक्रमण का उपयोग ईडब्ल्यूएस डोमेन में म्यूटेशन से जुड़े कार्यात्मक घाटे को चित्रित करने के लिए इन संरचनाओं को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्टोम का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। ईडब्ल्यूएस/फ्लाई डीएनए बाइंडिंग रूपांकनों, और जीनोमिक स्थानीयकरण के बारे में पहले प्रकाशित जानकारी के साथ ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषणों को एकीकृत करके, साथ ही क्षमता को बदलने के लिए कार्यात्मक परखें, हम ओन्कोजेनेसिस के लिए महत्वपूर्ण ईडब्ल्यूएस/फ्लाई लक्ष्य जीन के एक उपन्यास सेट को परिभाषित करने में सक्षम थे। यह पेपर ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के आंतरिक रूप से अव्यवस्थित डोमेन के संरचना-कार्य संबंधों को मैप करने के लिए एक विधि के रूप में आरएनए-अनुक्रमण के उपयोग को दर्शाता है।
कैंसर के एक सबसेट, जिसमें बचपन और किशोरावस्था के कई घातक लोग शामिल हैं, क्रोमोसोमल ट्रांसलोकेशन की विशेषता हैजो1, 2,3,4,5,6पर उपन्यास संलयन उत्पन्न करते हैं। परिणामस्वरूप संलयन प्रोटीन अक्सर ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के रूप में कार्य करते हैं, ट्यूमरजीनेसिस7,8को बढ़ावा देने के लिए ट्रांसक्रिप्शनल नियमन में व्यापक परिवर्तन करते हैं। इन ट्रांसलोकेशन वाले कैंसर में आमतौर पर एक अन्यथा शांत उत्परिवर्तनीय परिदृश्य होता है, जिसमें पाथोनोमोनिक फ्यूजन4,9से अलग कुछ आवर्ती जीनोमिक विपथन होते हैं। जैसे, सीधे फ्यूजन प्रोटीन को लक्षित करना इन बीमारियों में एक आकर्षक चिकित्सीय रणनीति है। हालांकि, इन ऑनकोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों में आमतौर पर कम जटिलता, आंतरिक रूप से अव्यवस्थित, प्रतिलेखन रूप से सक्रिय डोमेन होता है जो डीएनए-बाध्यकारी डोमेन (डीबीडी)10, 11,12,13,14के साथ जुड़ा हुआ है। इन प्रोटीनों के आंतरिक रूप से अव्यवस्थित डोमेन (आईडीडी) और डीबीडी दोनों पारंपरिक औषधीय दृष्टिकोणों के साथ लक्षित करना मुश्किल साबित हुआ है। उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोणों के विकास, इसलिए, जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए इन संलयन द्वारा नियोजित तंत्रों की अधिक विस्तृत आणविक समझ की आवश्यकता होती है।
EWSR1 के एन टर्मिनल IDD भाग आमतौर पर कैंसर में एक DBD के लिए जुड़ा हुआ है, ईविंग सारकोमा में EWS/FLI सहित, ईडब्ल्यूएस/WT1 फैलाना छोटे दौर सेल ट्यूमर में, और EWS/ATF1 नरम भागों के स्पष्ट सेल सारकोमा में10। इनमें से प्रत्येक फ्यूजन में ईडब्ल्यूएस आइडी की यंत्रवादी भूमिका को अधूरा समझ में आता है। ईडब्ल्यूएस/ईटीएस परिवार, विशेष रूप से ईडब्ल्यूएस/एफएलआई, आज तक सबसे कार्यात्मक रूप से विशेषता है । ईडब्ल्यूएस/फ्ली जीनोम-व्यापी एपिजेनेटिक और ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों का समन्वय करता है जिससे हजारों जीन 7 , 11,15,16की सक्रियता और दमनहोताहै । अध्ययनों से पता चला है कि आइडी ट्रांसक्रिप्शनल सह-सक्रियकों (जैसे पी 300, डब्ल्यूडीआर 5, और बीएएफ परिसर) की भर्ती के साथ-साथ सह-दमनकर्ताओं (जैसे न्यूआरडी परिसर)11,15,17की भर्ती के लिए महत्वपूर्ण है। FLI1 के सी-टर्मिनल भाग के लिए ईडब्ल्यूएस आईडीडी का संलयन FLI1 के ईटीएस डीबीडी को उपन्यास डीएनए-बाध्यकारी विशिष्टता प्रदान करता है, जैसे कि संलयन ओनकोप्रोटीन (ईडब्ल्यूएस/फ्लाई) आमसहमति 18,19,20के अलावा जीनोम के दोहराव जीजीए-माइक्रोसेटेलाइट क्षेत्रों को बांधता है। सह-सक्रियक भर्ती समारोह के साथ संयुक्त, ईडब्ल्यूएस/एफएलआई की यह आकस्मिक डीएनए-बाध्यकारी गतिविधि जीजीएए-माइक्रोसेटेलाइट्स डिस्टल में ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट्स (टीएसएस) (“एन्हांसर-लाइक” माइक्रोसेटेलाइट्स) और डी नोवो एन्हांसर गठन को बढ़ावा देती है। जीजीए-माइक्रोसेटेलाइट्स पर ट्रांसक्रिप्शन को बढ़ावा देने के लिए आरएनए पॉलीमरेज II को टीएसएस (“प्रमोटर की तरह” माइक्रोसेटेलाइट्स)11,15,16,21में ट्रांसक्रिप्शन को बढ़ावा देनेकेलिए भर्ती करता है ।
एक साथ लिया, इन आंकड़ों ने हमें यह परिकल्पना करने के लिए नेतृत्व किया कि ईडब्ल्यूएस डोमेन के भीतर असतत तत्व विभिन्न प्रकार के ईडब्ल्यूएस/फ्लाई बाध्यकारी साइटों में अलग-अलग सह-नियामकों की भर्ती में योगदान देते हैं। हालांकि, ईडब्ल्यूएस/एफएलआई के ईडब्ल्यूएस भाग के भीतर इन तत्वों को समझदार करना, और वे कैसे कार्य करते हैं, डोमेन की अत्यधिक दोहराव और अव्यवस्थित प्रकृति से बाधित किया गया है । यहां हम ईडब्ल्यूएस आईडीडी में इन तत्वों को कार्यात्मक रूप से मैप करने के लिए ईविंग सारकोमा कोशिकाओं में पहले से प्रकाशित नॉकडाउन-बचाव प्रणाली का उपयोग करते हैं। इस प्रणाली में ईडब्ल्यूएस/फ्लाई FLI FLI 1 जीन के 3’यूटीआर को लक्षित करने वाले एक श्र्ना का उपयोग करके समाप्त हो जाता है, और अभिव्यक्ति को अलग-अलग ईडब्ल्यूएस/फ्लाई उत्परिवर्ती सीडीएनए के साथ बचाया जाता है जिसमें 3’यूटीआर7,17,22की कमी होती है। इन प्रयोगों ईडब्ल्यूएस IDD और महत्वपूर्ण oncogeniclite रिपोर्टर निर्माण, कॉलोनी गठन परख, और ईडब्ल्यूएस/FLI सक्रिय और दमित जीन7,17,22 के सक्रियण सहित के बीच संरचना समारोह संबंध नक्शा करने के लिए विभिन्न विलोपन के साथ निर्माण पर ध्यान केंद्रित . हालांकि, इन अध्ययनों को ईडब्ल्यूएस/FLI में ईडब्ल्यूएस IDD के भीतर असतत उप-डोमेन खोजने में विफल रहा है जो या तो सक्रियण या दमन के लिए विशिष्ट रूप से महत्वपूर्ण हैं । सभी परीक्षण किए गए निर्माण या तो विशिष्ट लक्ष्य जीन को सक्रिय और दबाने में सक्षम थे, जिससे कुशल कॉलोनी गठन होता है, या किसी भी ईडब्ल्यूएस/फ्ली लक्ष्य जीन को विनियमित करने में असमर्थ होता है, जिससे कॉलोनीगठन 7, 17,22का नुकसान होता है।
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण को व्यापक रूप से अपनाने से सक्षम ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण आमतौर पर स्क्रीनिंग या वर्णनात्मक अध्ययनों के संदर्भ में दो स्थितियों में जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षरों की तुलना करने के लिए उपयोग किया जाता है। इसके बजाय हम ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर फ़ंक्शन में आईडीडी के योगदान की विशेषता के लिए आरएनए-अनुक्रमण (आरएनए-एसईक्यू) का उपयोग करके जीनोम-व्यापी अभिव्यक्ति डेटा को कैप्चर करने की क्षमता का लाभ उठाना चाहते थे। इस मामले में आरएनए-एसईक्यू को ईडब्ल्यूएस डोमेन के संरचना-कार्य संबंधों का पता लगाने के लिए नॉकडाउन-बचाव प्रणाली के साथ जोड़ा गया है। यह दृष्टिकोण अन्य संलयन प्रतिलेखन कारकों पर लागू होता है, जिसमें खराब समझे जाने वाले कार्य के साथ अन्य ईडब्ल्यूएस फ्यूजन या वाइल्डटाइप ट्रांसक्रिप्शन कारक शामिल हैं, और कार्यात्मक मानचित्रण अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य परखों पर कई फायदे हैं, जैसे रिपोर्टर परख या लक्षित क्यूआरटी-पीसीआर। इनमें प्रासंगिक क्रोमेटिन संदर्भ में कार्य के संरचनात्मक निर्धारकों का परीक्षण करना, एक परख में कई प्रकार के प्रतिक्रिया तत्वों का परीक्षण करने की क्षमता (यानी, सक्रिय और दमित, जीजीएए-माइक्रोसेटेलाइट और गैर-माइक्रोसेटेलाइट, आदि) शामिल हैं, और परिणामस्वरूप आंशिक कार्य का बेहतर पता लगाने की क्षमता शामिल है।
इस दृष्टिकोण का सफल कार्यान्वयन एक सेल-आधारित प्रणाली पर निर्भर करता है जो ब्याज के फेनोटाइप को कैप्चर करता है (इस मामले में ए 673 कोशिकाओं के साथ shRNA-मध्यस्थता ईडब्ल्यूएस/फ्ली कमी), और उत्परिवर्ती का एक पैनल सेल-आधारित प्रणाली के लिए उपयुक्त अभिव्यक्ति वेक्टर में निर्माण करता है (इस मामले में, विभिन्न 3x-फ्लैग-टैग ईडब्ल्यूएस/फ्ली म्यूटेंट के साथ एलएमएससीवी-हाइग्रो को रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन द्वारा वितरित किया जाएगा। या तो CRISPR आधारित कमी निर्माण, shRNA आधारित कमी निर्माण, और सीडीएनए अभिव्यक्ति के वायरल लेनदेन के लिए स्थिर सेल लाइनों को उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त चयन के साथ निर्माण क्षणिक परिवर्तन पर सिफारिश की है । परिणामों की डाउनस्ट्रीम व्याख्या को तब मजबूत किया जाता है जब ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा को ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर और अन्य फेनोटाइपिक रीडआउट के स्थानीयकरण से संबंधित अन्य डेटा के साथ जोड़ा जा सकता है जहां उपलब्ध है।
इस पेपर में, हम ईडब्ल्यूएस/फ्ली14के डीएएफ उत्परिवर्ती की गतिविधि की विशेषता के लिए इस दृष्टिकोण को लागू करते हैं। डीएएफ उत्परिवर्ती ईडब्ल्यूएस/एफएलआई 14 के ईडब्ल्यूएस आइडी के दोहराव वाले क्षेत्रों में एलनिन म्यूटेशन के लिए17टायरोसिन है । इस विशेष ईडब्ल्यूएस उत्परिवर्ती को पहले सूचित किया गया था और एटीएफ1 डीबीडी14से जुड़े होने पर रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति को सक्रिय करने में असमर्थ है । हालांकि, प्रारंभिक क्यूआरटी-पीसीआर डेटा ने सुझाव दिया कि यह उत्परिवर्ती ईडब्ल्यूएस/फ्ली लक्ष्य एनआर0बी123के प्रतिलेखन को सक्रिय करने में सक्षम था । यहां वर्णित ट्रांसक्रिप्टोमिक दृष्टिकोण ने डीएएफ उत्परिवर्ती के आंशिक कार्य का सफल पता लगाने में सक्षम बनाया। ईडब्ल्यूएस/फ्लाई बाइंडिंग और रिकग्निशन रूपांकनों के बारे में जानकारी के साथ इन ट्रांसक्रिप्टॉमिक डेटा को बांधकर हम आगे बताते हैं कि डीएएफ उत्परिवर्ती जीजीएए-माइक्रोसेटेललाइट में कार्य को बरकरार रखता है। ये परिणाम डीएएफ को पहले आंशिक रूप से कार्यात्मक ईडब्ल्यूएस/फ्ली म्यूटेंट के रूप में पहचानते हैं और गैर-माइक्रोसेटेलीलाइट जीन पर हाइलाइट फ़ंक्शन को ऑन्कोजेनेसिस के लिए महत्वपूर्ण (जैसा कि23रिपोर्ट किया गया है) । यह ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के कार्य में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए इस ट्रांसक्रिप्टॉमिक संरचना-फ़ंक्शन मैपिंग दृष्टिकोण की शक्ति को दर्शाता है।
ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के जैव रासायनिक तंत्र का अध्ययन उनके कारण होने वाली बीमारियों को समझने और नई चिकित्सीय रणनीतियों को डिजाइन करने के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। यह गुणसूत्र ट्रांसलोकेशन के परिणामस्वरूप गुणसूत्र ट्रांसलोकेशन की विशेषता वाले घातक गुणों में विशेष रूप से सच है। इन चिमरिक प्रोटीन में शामिल डोमेन में जंगली प्रकार के प्रोटीन में मौजूद नियामक डोमेन के साथ सार्थक बातचीत की कमी हो सकतीहै, जो संलयन26, 27,28के संदर्भ में संरचना-कार्य जानकारी की व्याख्या करने की क्षमता को जटिल बनासकताहै। इसके अलावा, इनमें से कई ऑनकोजेनिक फ्यूजन कम जटिलता आंतरिक रूप से अस्त-व्यस्त डोमेन10,13,29,30की विशेषता है।
ईडब्ल्यूएस डोमेन इस तरह के आंतरिक रूप से अव्यवस्थित डोमेन का एक उदाहरण है जो विभिन्न प्रकार के ऑन्कोजेनिक फ्यूजन10में शामिल है। आंतरिक रूप से अव्यवस्थित और दोहराव प्रकृति ने ईडब्ल्यूएस डोमेन द्वारा नियोजित आणविक तंत्रों को समझने के प्रयासों में रुकावट पैदा की है । संरचना-कार्य की जांच करने के पूर्व प्रयासों ने काफी हद तक रिपोर्टर जीन परख के संदर्भ में या सेल पृष्ठभूमि में विभिन्न म्यूटेंट का उपयोग करने का सहारा लिया है जो प्रासंगिक सेलुलर संदर्भ को पुनः प्राप्त करने में विफल रहते हैं, या किसी भी संरचनात्मक विविधताओं की कमी है जो सार्थक आंशिक कार्य11,17,25का उत्पादन करते हैं। यहां प्रस्तुत विधि इन मुद्दों को संबोधित करती है । संरचना-फ़ंक्शन मानचित्रण रोग-प्रासंगिक कोशिका संदर्भ में किया जाता है और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण देशी क्रोमेटिन की स्थापना में ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग को सक्षम बनाता है। EWS/FLI के DAF उत्परिवर्ती के विशिष्ट मामले में, DAF को अलग प्रतिक्रिया तत्वों का उपयोग कर रिपोर्टर परख में कम गतिविधि दिखाने की सूचना दी गई थी, लेकिन पूर्ण जीन प्रमोटर के संदर्भ में गतिविधि दिखाने के लिए, या तो एक रिपोर्टर परख में या देशी क्रोमेटिन में, एक दिलचस्प फेनोटाइप23का सुझाव । यहां वर्णित विधि का उपयोग करना अधिक सीधे इस सवाल को हल करता है कि जीनोम में किस प्रकार के नियामक तत्व रोग सेटिंग में सबसे अधिक उत्तरदायी हैं। सभी उम्मीदवार अपने मूल क्रोमेटिन संदर्भ में जीन को एक साथ परीक्षण करके, एक ट्रांसक्रिप्टोमिक दृष्टिकोण आंशिक कार्य के साथ निर्माणों की पहचान करने की अधिक संभावना है।
रोग-प्रासंगिक कोशिका पृष्ठभूमि का उपयोग करने की अंतर्निहित ताकत शायद इस तकनीक की सबसे बड़ी सीमा है। सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक इन प्रयोगों के लिए उपयुक्त सेल प्रणाली का चयन है। रोगोग्नोनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के साथ घातक से प्राप्त कई सेल लाइनें आसानी से उस प्रतिलेखन कारक के नॉकआउट को बर्दाश्त नहीं करती हैं, और कई उदाहरणों में, विशेष रूप से बाल चिकित्सा कैंसर के लिए, मूल की असली कोशिका विवादास्पद बनी हुई है और अन्य सेल पृष्ठभूमि में ऑन्कोजीन की अभिव्यक्ति निषेधात्मक रूप से विषाक्त है31,32 . इन मामलों में, यह एक अलग सेल पृष्ठभूमि में प्रयोग करने के लिए उपयोगी हो सकता है, जब तक शोधकर्ता परिणामों की व्याख्या में सावधानी बरतता है और उचित रूप से अधिक रोग-प्रासंगिक कोशिका प्रकार में किसी भी प्रासंगिक निष्कर्षों को मान्य करता है।
ऑन्कोजीन की अभिव्यक्ति के स्थिरता और फेनोटाइपिक परिणामों को सावधानीपूर्वक मान्य करना और सख्त मानदंडों को पूरा करने वाले अनुक्रमण के लिए केवल नमूने प्रस्तुत करना गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। यहां, इसमें नॉकडाउन और बचाव की पुष्टि करने के लिए पश्चिमी दाग शामिल थे, और सकारात्मक नियंत्रण(चित्रा 2)को मान्य करने के लिए ज्ञात लक्ष्य जीन की एक छोटी संख्या की क्यूआरटी-पीसीआर शामिल थी। इसी तरह प्रत्येक बैच के माध्यम से सेल और आरएनए की तैयारी को ध्यान से निष्पादित करके जितना संभव हो उतना बैच परिवर्तनशीलता को कम करना महत्वपूर्ण है।
यहां वर्णित विधि विशेष रूप से शक्तिशाली हो जाती है जब अन्य प्रकार के जीनोमिक डेटा के साथ जोड़ा जाता है जो अध्ययन के तहत ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के जीनोम-वाइड फ़ंक्शन से बात करते हैं। इस प्रकार की संरचना-कार्य विश्लेषण के लिए भविष्य के निर्देशों में प्रतिलेखन कारक के बाध्यकारी और क्रोमेटिन पहुंच में किसी भी प्रेरित परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए ChIP-seq और ATAC-seq शामिल करने के लिए विस्तार होगा । एक सुइट के रूप में, इस प्रकार के डेटा इस बात की ओर इशारा कर सकते हैं कि ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के विभिन्न संरचनात्मक घटक कार्य के विभिन्न पहलुओं में योगदान देते हैं (यानी डीएनए बाध्यकारी बनाम क्रोमेटिन संशोधन बनाम सह-नियामक भर्ती)। कुल मिलाकर, संलयन प्रतिलेखन कारकों के संरचना-कार्य संबंधों को मैप करने के लिए एनजीएस-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करने से इन प्रोटीनों के ऑन्कोजेनिक फ़ंक्शन के जैव रासायनिक निर्धारकों में नई अंतर्दृष्टि प्रकट हो सकती है। यह उनके कारण और नई चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को सक्षम करने में रोगों के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है ।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को राष्ट्रव्यापी बाल अस्पताल में अबीगैल वेक्सनर रिसर्च इंस्टीट्यूट में हाई परफॉर्मेंस कंप्यूटिंग फैसिलिटी ने सपोर्ट किया । इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट [U54 CA231641 से SLL, R01 CA183776 से SLL] द्वारा समर्थित किया गया था; एलेक्स नींबू पानी स्टैंड फाउंडेशन [ईआरटी को युवा अन्वेषक पुरस्कार]; पेलोटोनिया [ईआरटी के लिए फैलोशिप]; और राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद सीजे मार्टिन ओवरसीज बायोमेडिकल फैलोशिप [APP1111032 से किप] ।
Wet Lab Reagents | |||
anti-FLI rabbit pAb | Abcam | ab15289 | 1:500 |
anti-lamin B1 rabbit pAb | Abcam | ab16048 | 1:2000 |
Cell-based system for introduction of mutant constructs | Determined by cell system used | ||
Cryotubes | For viral aliquots | ||
DMEM | Corning Cellgro | 10-013-CV | For viral production |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | For viral production |
G418 | ThermoFisher | 10131027 | For viral production |
HEK293-EBNAs | ATCC | CRL-10852 | For viral production |
HEPES | Gibco | 15630106 | |
Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
M2 anti-FLAG mouse mAb | Sigma | F3165 | 1:2000 |
Near IR-secondary antibodies | Li-Cor | ||
Optimem | Gibco | 31985062 | For viral production |
Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | For viral production |
Polybrene | Sigma | TR-1003-G | For viral transduction |
Puromycin | Sigma | P8833 | Stored at 2 mg/mL stock |
RNeasy Plus kit | Qiagen | 74136 | Has gDNA removal columns |
Selection reagents | As dictated by cell system used | ||
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | For viral production |
Tissue culture media | Determined by cell system used | ||
TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2304 | For viral production |
Software | |||
Access to HPC environment | |||
AnnotationDbi | 1.38.2 | ||
Cairo | 1.5-10 | ||
DESeq2 | 1.16.1 | ||
genefilter | 1.58.1 | ||
ggbiplot | 0.55 | ||
ggplot2 | 3.1.1 | ||
org.Hs.eg.db | 3.4.1 | ||
pheatmap | 1.0.12 | ||
PuTTY | |||
R | 3.4.0 | ||
RColorBrewer | 1.1-2 | ||
reshape2 | 1.4.3 | ||
rgl | 0.100.19 | ||
R-studio | |||
STAR | Version 2.6 or later | ||
sva | 3.24.4 | ||
TrimGalore! | |||
WinSCP |