Проточная цитометрическая характеристика развития В-клеток мышей
Summary
Мы описываем здесь простой анализ гетерогенности компартмента иммунных В-клеток мышей в тканях брюшины, селезенки и костного мозга с помощью проточной цитометрии. Протокол может быть адаптирован и распространен на другие ткани мыши.
Abstract
Обширные исследования характеризуют развитие и дифференцировку мышиных В-клеток во вторичных лимфоидных органах. Антитела, секретируемые В-клетками, были выделены и развиты в хорошо зарекомендовавшие себя терапевтические средства. Валидация развития В-клеток мышей в контексте аутоиммунных склонных мышей или у мышей с модифицированной иммунной системой является важнейшим компонентом разработки или тестирования терапевтических агентов на мышах и является надлежащим использованием проточной цитометрии. Хорошо зарекомендовавшие себя цитометрические параметры потока В-клеток могут быть использованы для оценки развития В-клеток в брюшине мышей, костном мозге и селезенке, но необходимо придерживаться ряда лучших практик. Кроме того, проточный цитометрический анализ компартментов В-клеток должен также дополнять дополнительные показания развития В-клеток. Данные, полученные с помощью этого метода, могут способствовать нашему пониманию моделей мышей дикого типа, склонных к аутоиммунным заболеваниям, а также гуманизированных мышей, которые могут быть использованы для генерации антител или молекул, подобных антителам, в качестве терапевтических средств.
Introduction
Моноклональные антитела все чаще становятся предпочтительной терапией для многих заболеваний человека, поскольку они становятся частью основной медицины1,2. Ранее мы описали генетически модифицированных мышей, которые эффективно вырабатывают антитела, скрывающие полностью переменные области человека с константами IgH мыши3,4. Совсем недавно мы описали генетически модифицированных мышей, которые продуцируют антителоподобные молекулы, которые имеют отчетливое связывание антигенов5. Антитела секретируются В-клетками и составляют основу адаптивного гуморального иммунитета. Существует два различных типа В-клеток, B-1 и B-2. У млекопитающих клетки B-1 возникают в печени плода и обогащаются тканями слизистой оболочки и плевральной и брюшной полостями после рождения, в то время как клетки B-2 возникают в печени плода до рождения, а затем в костном мозге (БМ). Клетки B-2 обогащаются вторичными лимфоидными органами, включая селезенку и кровь6,7,8. В БМ гемопоэтические предшественники B-2 начинают дифференцироваться в про-В-клетки после инициирования перестройки тяжелой цепи Ig mu9,10. Успешная перестройка тяжелой цепи Ig и ее сборка в пре-В-клеточный рецептор (пре-BCR), наряду с сигнальной и пролиферативной экспансией, приводит к дифференцировке в пре-В-клетки. После того, как пре-В-клетки перестраивают свои легкие цепи Ig kappa (Igκ) или, если это непродуктивно, легкие цепи Ig lambda (Igλ), они соединяются с μ тяжелой цепи, что приводит к поверхностной экспрессии IgM BCR. Важно отметить, что поверхностная экспрессия IgM, как известно, снижается в условиях аутореактивности, что способствует самотолерантности в функционально невосприимчивых или анергических В-клетках11,12. Незрелые В-клетки затем вступают в переходную стадию, где они начинают совместно экспрессировать IgD и мигрируют из БМ в селезенку. В селезенке экспрессия IgD еще больше увеличивается, и клетки созревают во вторую стадию переходных В-клеток, за которой следует завершение их статуса созревания и развитие либо в клетки маргинальной зоны (MZ), либо в фолликулярные (Fol) клетки13,14,15. У взрослых мышей, в неболеющих условиях, количество зрелых В-клеток остается постоянным, несмотря на то, что ежедневно в БМ генерируется 10-20 миллионов незрелых В-клеток. Из них только три процента попадают в пул зрелых В-клеток. Размер периферического В-клеточного компартмента ограничен гибелью клеток, отчасти из-за нескольких факторов, включая самореактивность и неполное созревание16,17,18. Проточный цитометрический анализ широко использовался для характеристики и перечисления многих субкомпонентов иммунных клеток у людей и мышей. Хотя существует некоторое сходство между человеческими и мышиными В-клеточными компартментами, этот протокол применяется только к анализу мышиных В-клеток. Этот протокол был разработан с целью фенотипирования генетически модифицированных мышей, чтобы определить, изменят ли генетические манипуляции развитие В-клеток. Проточная цитометрия также была чрезвычайно популярна во многих дополнительных приложениях, в том числе при измерении активации клеток, функции, пролиферации, анализа циклов, анализа содержания ДНК, апоптоза и сортировки клеток 19,20.
Проточная цитометрия является предпочтительным инструментом для характеристики различных лимфоцитарных компартментов у мышей и людей, в том числе в сложных органах, таких как селезенка, БМ и кровь. Благодаря широко доступным мышино-специфическим реагентам антител для проточной цитометрии, этот метод может быть использован для исследования не только белков клеточной поверхности, но и внутриклеточных фосфопротеинов и цитокинов, а также функциональных показаний21. Здесь мы демонстрируем, как реагенты проточной цитометрии могут быть использованы для идентификации подмножеств В-клеток по мере их созревания и дифференцировки во вторичных лимфоидных органах. После оптимизации условий окрашивания, обработки образцов, правильной настройки прибора и сбора данных и, наконец, анализа данных можно использовать протокол комплексного проточного цитометрического анализа компартмента В-клеток у мышей. Такой комплексный анализ основан на десятилетней номенклатуре, разработанной Харди и его коллегами, где развивающиеся клетки BM B-2 могут быть разделены на различные фракции (Fraction) в зависимости от их экспрессии B220, CD43, BP-1, CD24, IgM и IgD22. Hardy et al., показали, что B220+ CD43 BM B-клетки могут быть подразделены на четыре подмножества (фракция A-C’) на основе экспрессии BP-1 и CD24 (30F1), в то время как B220+ CD43-(тусклые до отрицательных) BM B-клетки могут быть разрешены на три подмножества (фракция D-F) на основе дифференциальной экспрессии IgD и поверхностного IgM23. Фракция A (пре-про-В клетки) определяется как BP-1-CD24 (30F1)–, фракция B (ранние про-В-клетки) определяется как BP-1-CD24 (30F1)+, фракция C (поздние про-В-клетки) определяется как BP-1+ CD24 (30F1)+, а фракция C’ (ранние клетки пре-В) определяется как BP-1+ и CD24high. Кроме того, фракция D (пре-В-клетки) определяется как B220+ CD43-IgM-В-клетки, а фракция E (вновь генерируемые В-клетки, комбинация незрелых и переходных) определяется как B220+ CD43-IgM+ В-клетки, а фракция F (зрелые, рециркулирующие В-клетки) определяется как B220-высокие CD43-IgM+ В-клетки. Напротив, большинство наивных В-клеток, обнаруженных в селезенке, можно разделить на зрелые (B220 + CD93-) В-клетки и переходные (T1, T2, T3) клетки в зависимости от экспрессии CD93, CD23 и IgM. Зрелые В-клетки могут быть разрешены на маргинальные зоны и фолликулярные подмножества на основе экспрессии IgM и CD21/CD35, а фолликулярные подмножества могут быть дополнительно разделены на зрелые фолликулярные подмножества клеток типа I и фолликулярные подмножества В-клеток типа II в зависимости от уровня их поверхностной экспрессии IgM и IgD24. Эти селезеночные популяции В-клеток экспрессируют преимущественно Igκ легкую цепь. Наконец, популяции В-клеток B-1, которые происходят из печени плода и в основном находятся в брюшной и плевральной полостях взрослых мышей, были описаны в литературе. Эти перитонеальные В-клетки можно отличить от ранее описанных В-2 В-клеток по отсутствию экспрессии CD23. Затем они далее подразделяются на популяции B-1a или B-1b, причем первые определяются присутствием CD5, а вторые – его отсутствием25. Предшественники клеток B-1 в изобилии присутствуют в печени плода, но не обнаруживаются во взрослом БМ. Хотя клетки B-1a и B-1b происходят от разных предшественников, они оба засеивают брюшную и плевральную полости24. В отличие от клеток B-2, клетки B-1 уникально способны к самообновлению и отвечают за выработку естественных антител IgM.
Дефекты в развитии В-клеток могут возникать во многих случаях, включая недостатки в компонентах BCR26,27, возмущения сигнальных молекул, которые влияют на силу передачи сигналов BCR14,28,29, или нарушение цитокинов, которые модулируют выживание В-клеток30,31 . Анализ проточной цитометрии лимфоидных компартментов способствовал характеристике блоков развития В-клеток у этих мышей и многих других. Одним из преимуществ проточного цитометрического анализа лимфоидных компартментов является то, что он предлагает возможность проводить измерения на отдельных клетках, полученных из живой диссоциированной ткани. Наличие реагентов в постоянно расширяющемся диапазоне флуорофоров позволяет проводить одновременный анализ нескольких параметров и позволяет оценивать гетерогенность В-клеток. Кроме того, перечисление В-клеток методом проточного цитометрического анализа дополняет другие иммунологические анализы, такие как методы иммуногистохимии, которые визуализируют локализацию клеток в лимфоидных органах, обнаружение уровней циркулирующих антител в качестве меры гуморального иммунитета, а также две фотонные микроскопии для измерения реакций В-клеток в реальном пространстве и времени32.
Protocol
Representative Results
Discussion
Проточный цитометрический анализ лимфоидных и нелимфоидных тканей позволил одновременно идентифицировать и перечислить субпопуляции В-клеток у мышей и людей с 1980-х годов. Он был использован в качестве меры гуморального иммунитета и может быть применен в дальнейшем для оценки функцио…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Мэтью Слимана за критическое прочтение рукописи. Мы также благодарим отделы операций вивария и проточной цитометрии в Regeneron за поддержку этого исследования.
Materials
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
References
- Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), 220 (2017).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
- Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
- Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
- Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
- Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
- Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
- Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
- von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
- Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
- Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
- Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
- Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
- Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
- Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
- Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
- Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
- McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
- Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
- Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
- Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
- Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
- Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
- Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
- Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
- Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
- Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
- Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
- Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , 21 (2007).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).
