Presenteras här är ett protokoll för en standardiserad in vitro hemodynamic loop modell. Denna modell gör det möjligt att testa hemocompatibility av perfusionsrör eller vaskulär stent vara i enlighet med ISO (International Organization for Standardization) standard 10993-4.
I denna studie jämfördes hemocompatibilityen av rör med en inre diameter av 5 mm gjort av polyvinylchlorid (PVC) och belagt med olikt bioactive konjugates till obestruket PVC rör, latexrör, och en stent för intravaskulär applikation som placerades insida PVC-rören. Utvärdering av hemocompatibility gjordes med hjälp av en in vitro hemodynamic loop modell som rekommenderas av ISO-standarden 10993-4. Rören skars i segment av identisk längd och stängdes för att bilda slingor undvika eventuella gap vid skarv, sedan fylls med humant blod och roteras i ett vattenbad vid 37 °C i 3 timmar. Därefter samlades blodet inuti rören för analys av hela blodkroppar, hemolys (gratis plasma hemoglobin), komplementsystem (sC5b-9), koagulationssystem (fibrinopeptide A), och leukocyte aktivering (polymorfouklear elastase, tumörnekrosfaktor och interleukin-6). Host cell aktivering fastställdes för trombocyt aktivering, leukocyte integrin status och monocyter trombocyt aggregat med hjälp av flödescytometri. Effekten av felaktiga loop stängning undersöktes med röntgen mikrotomografi och scanning elektronmikroskopi, som visade trombbildning vid skarv. Latex rör visade den starkaste aktiveringen av både plasma och cellulära komponenter i blodet, vilket indikerar en dålig hemocompatibility, följt av stent gruppen och obestruket PVC rör. De belagda PVC-rören visade inte en signifikant minskning av trombocytaktiveringsstatus, men visade en ökad komplement och koagulationskaskad jämfört med obestrukna PVC-rör. Loopmodellen i sig ledde inte till aktivering av celler eller lösliga faktorer, och hemolysnivån var låg. Därför den presenterade in vitro hemodynamic loop modellen undviker överdriven aktivering av blodkomponenter av mekaniska krafter och fungerar som en metod för att undersöka in vitro-interaktioner mellan givaren blod och vaskulär medicintekniska produkter.
Hemocompatibility testning av medicintekniska produkter är ett avgörande steg i utvecklingen av nya enheter såsom vaskulär stent eller perfusionsrör för extrakorporeal membran syresättning. Fram till idag betraktas djurmodeller som standardverktyg för att slutföra proceduren för att testa de medicintekniska enheterna innan det genomförs på människor. Hädanefter är det nödvändigt att finna alternativa in vitro-modeller som ytterligare stöd för att minimera undersökningar på djur. I denna studie har vi därför utforskat en miniatyr in vitro hemodynamic loop modell. Målet med denna presenterade metod är att testa medicintekniska produkters in vitro-blod i enlighet med standarden ISO 10993-4.
ISO 10993-4-standarden beskriver standardiserade uppsättningar kliniska parametrar som ska undersökas på blodexemplar1. Kortfattat är dessa trombos (trombocys (trombocytaggregation och räkning), koagulation (fibrinopeptide A, FPA), blodsjukdomar analys (hela blodkroppar), hemolysindex (fritt plasma hemoglobin) och komplementsystemet (terminal komplementkomplex, sC5b9). Ytterligare markörer, såsom neutrofil polymorfonuklear elastase (PMN), interleukin 6 (IL-6) och tumörnekrosfaktor – alfa (TNF) som återspeglar aktiveringsstatus av leukocyter kan dock också redovisas för mätningar. För att bestämma och att kvantifiera de cirkulerande cell fria proteiner som finns i blodplasma, sandwich enzymatisk länkade immunosorbent assay (ELISA) representerar en konventionell och mest tillförlitligametod 2,3. Likaså kan hostcellens fenotyp och aktiveringsstatus (t.ex. leukocyter) kvantifieras genom att detektera cellytan uttryck för molekyler genom flödescytometri (FACS) som ger encelliga suspension baserade avläsningar, där fluorescerade specifika antikroppar binder till de riktade cellytansmolekyler 4. Scanning elektronmikroskopi (SEM) rekommenderas också att bestämma trombbildning på det testade materialet av ISO 10993-4 standard1. Denna metod kan kompletteras med röntgenmikrotomografi (μCT), för att utföra strukturell analys av trombusen t.ex., dess tjocklek, storlek och lokalisering i en 3D-renderad bild5.
Logiken bakom med hjälp av denna in vitro-hemodynamiska modellen är att skärmen för de bästa och kompatibla medicintekniska produkter genom att förstå den grundläggande fysiologiska dynamiken i blodkomponenter såsom blodplättar, som är involverade i den primära hemostas eller leukocyter och deras interaktion med olika typer av kärltekniska produkter. Sådana in vitro-system är mycket efterfrågade eftersom de minskar behovet av djurstudier.
Den här presenterade loopmodellen uppfyller dessa krav. Denna modell beskrevs först av A.B. Chandler 1958 för produktion av blod thrombi och är, därför, även kallad Chandler Loop modell6. Hittills har denna modell använts i en serie experiment och modifieringar för att undersöka blod biokompatibiliteten hos medicintekniskaprodukter 7,8,9,10,11,12,13,14. Den består av polymerrör, som delvis fylls med blod och formas till återklosbara slingor. Dessa slingor roterar i ett temperaturkontrollerat vattenbad för att simulera kärlflödesförhållanden med dess hemorheologiska effekter. Alternativa metoder som pumpdrivna modeller eller modeller som använder mekaniska kulventiler inuti slingorna för att framkalla ett blodflöde inuti polymerrören har redan beskrivits15,16. Den totala fördelen med den här presenterade metoden är dock att den mekaniska kraft som appliceras på blodkropparna och proteinerna är låg, undvika hemolys, och det finns ingen kontakt mellan blod och kontaktdon, som eventuellt kan leda till flödesturbulenser och aktivering av blodkomponenter. De viktigaste aktiverande faktorerna inuti slingan är själva testmaterialet och luften som är instängd. Detta bidrar till att minimera källor för mätning fel och att leverera en hög reproducerbarhet, även om blod-luft gränssnittet kan leda till protein denaturering17. Det är också möjligt att undersöka sorter av slangmaterial och stentdiametrar utan längd eller storleksbegränsningar och därigenom tillåta användning av rör av olika längd och innerdiameter. Dessutom är värd hemocompatibilities på felaktiga slinga stängning och exponering för den obelagda röret ytan är också möjligt att undersöka. Andra liknande medicinska tillämpningar av denna in vitro-hemodynamic loop modell är att det också skulle kunna användas för att studera samspelet mellan immunotherapeutics (läkemedel) och blodkomponenter under antingen preklinisk utveckling eller enskilda läkemedelssäkerhet screening före första-i-man fas I klinisk prövning, eller för generering av trombmaterial som kan användas i ytterligare experiment18,19,20.
Denna studie beskriver ett detaljerat protokoll för testning av hemocompatibilitiesna av perfusionsrör och/eller stent. Här, jämförelsen mellan obelagda och belagda PVC-rör (hepPVC: heparinbeläggning, polyPVC: beläggning med en bioaktiv polymer). Sänkt aktivering av trombocyter, men en högre aktivering av koagulationssystemet (FPA) hittades för båda belagda rören i jämförelse med de obelagda rören. De hepPVC-rör som används här modifieras med kovalent bundet heparin för att göra dem tromboresistanta21 och har redan varit anställda i en loopmodell för att optimera och karakterisera olika parametrar22. De polyPVC-rör som används i denna studie är kommersiellt tillgängliga rör som används i kliniska inställningar av extrakorporeal blodperfusion och är belagda med en heparinpolymer för att minska deras trombogenicitet23. Ibland, i kliniska tillämpningar även obestruket PVC-rör används. Därför inkluderade vi latexrör som en positiv kontrollgrupp som visade överdriven aktivering av trombocyter, koagulationssystem och lösliga faktorer som IL-6, TNF och PMN elastase. Thrombus bildandet märktes när felaktiga loop stängningen var simulerad. Detta ledde till aktivering av koagulering och komplementsystem samt leukocyter och trombocyter jämfört med baslinjeförhållandena. Vidare blod kontakt till här används stent material (bare metal nitinol stent, täckt med kol-impregnerade expanderade polytetrafluoreten) ledde till högre trombocyt och leukocyt aktivering i termer av PMN elastase. Sammantaget inducerar den presenterade modellen inte hemolys i någon av de testade kärlapparaterna eftersom de var jämförbara med baslinjen eller statiska förhållanden, utom för latexrören, där röda blodkroppar (RBC) hemolys var uppenbar. Dessa perfusionsrör kan dessutom undersökas antingen genom bildframställning eller genom histologi. Även om histologiska utvärderingar kan vara genomförbara, fokuserade vi främst på ELISA och flödescytometri för att utföra dessa experiment och därmed möjliggöra feasibilities att utföra experiment baserade på den här presenterade modellen för många laboratorier. Således representerar denna metod en genomförbar metod för att testa blod biokompatibiliteten hos vaskulär medicintekniska produkter i enlighet med rekommendationerna i ISO 10993-4-standarden. Vidare kan denna metod användas närhelst en interaktion mellan blod och material ska testas under flödesförhållanden, härma in vivo-förhållandena.
Denna studie har visat att den presenterade in vitro-hemodynamic loop-modellen erbjuder en tillförlitlig metod för att testa in vitro-blod kompatibilitet av medicintekniska produkter i enlighet med ISO 10993-4 standard.
Kritiska steg i protokollet inkluderar ritning av blod och fyllning av rören med blod, där överdrivet vakuum eller agitation bör undvikas för att förhindra att blodkomponenterna aktiveras genom hanteringsproceduren. Vidare är det mycket viktigt att omedelbart frysa plasmaproverna och hålla dem på is efter upptining, eftersom komplement- och koagulationssystemets aktivering kan manipuleras genom att hålla proverna på rumstemperaturen under längre tid.
Eftersom denna modell har både förtjänster och nackdelar när man jämför med andra in vitro-modeller, måste flera faktorer beaktas samtidigt utforma experimenten.
Först kan slingorna varieras i längd och diameter för att passa olika experimentella uppställningar. I fall att uppställningen omfattar kontrasterande rör av varierande innerdiametrar, bör man hålla i minnet att skillnaderna i diameter kommer att resultera i olika skjuvkrafter och därigenom påverka koagulation och komplementkaskad7. För det andra var rotationshastigheten inställd på 30 rpm i detta experiment. Detta kommer att resultera i ett blodflöde på cirka 25 cm/s, vilket är jämförbart med blodflödeshastigheten i människans kranskärlsbypasstransplantat25. Töjningshastigheten, som genereras av rotationen av slingorna, är den stora parametern som kommer att initiera biokemiska kaskader av blodkomponenter, inklusive celler och cellfria proteiner. Men eftersom blod är en icke-Newtonsk vätska, kommer stamhastigheten också att påverkas av rörkrökningen, respektive längden på de rör som är stängda för slingor10. Närhelst rotationshastigheten eller slingans storlek ändras är det viktigt att tänka på att korrelationen mellan töjningshastighet och rotationshastighet inte är linjär. Sambandet mellan rotationshastighet och töjningshastighet är inte tillräckligt undersökt förrän idag och ytterligare studier krävs för att undersöka dessa särskilda parametrar10,26,27. Baserat på en modell för laminärgränsskikt kan dock den givna rördiametern på 5 mm och rotationshastigheten på 25 cm/s, en grov uppskattning av väggskjuvningsstressen (WS S) skulle ange värden mellan 2,20-22,00 pascal för en sträcka av 1,00-0,01 mm till väggen av röret när blodtätheten beräknas vara 1060 kg * m-3 och kinetical viskositet är inställd på 0,0025 pascal * s28,29. Intressant, också en mer detaljerad beräkningsanalys av flödesdynamiken i krökning av mänskliga kranskärl visade WSS värden som sträcker sig från 11,33 till 16,77 pascal vid ungefär jämförbara parametrar för hastighet, densitet och viskositet av blodet30.
Bredvid denna begränsning är den presenterade loopmodellen ett tryck mindre system, som inte efterliknar de intravaskulära blodtryckskvoterna i det mänskliga kärlsystemet.
Nästa viktiga begränsning är att blodet är i kontakt med luft inuti slingorna, vilket medför ytterligare störningar. En sådan blod-luftkontakt påverkas av två parametrar, vilket inkluderar rörens gaspermeabilitet och kvarhålla luft inuti slingorna medan de fylls med blod. Varje rörmaterial besitter en viss gaspermeabilitet som kan leda till betydande förändringar i gaskoncentrationer inuti rören. Medan vissa författare uppger att den resulterande effekten av gasen permeabilitet på aktivering av blodkomponenter förbliroklart 31, är det känt att funktionen av blodet koagulatorer är mycket känslig för ett pH-skift, som kan orsakas av CO2 diffusion32,33,34. Här har vi testat biokompatibiliteten av blodperfusionsrör under inomhusluftsförhållanden, jämförbara med kliniska scenarier av extrakorporeal blodperfusion. För framtida förbättringar av den presenterade modellen, inkubation av hela modellen i en CO2 inkubator och utför blod pH validering före och efter inkubation kan vara lämpligt att ytterligare standardisera denna modell.
Också, blod-luft gränssnittet inuti slingorna kan leda till aktivering av plasmaproteiner och cellfraktioner av blodet35,36. Rullpumpen drivna enheter utan luft inuti rören kan undvika frågan om blod-luft gränssnitt, men de säkert framkalla skador på blodkroppar med betydande förhöjda nivåer av hemoglobin jämfört med den här presenterade loop modell, och hemoglobin i plasma kan störa känsligheten hos testade analyter i ELISA16. I denna studie har vi visat att den hemolytiska effekten av loopmodellen själv förblir minimal medan du använder biokompatibla material som heparinbelagda PVC-rör. Således är modellen, å ena sidan, inte orsakar alltför stora cellskador jämfört med pumpdrivna modeller, men å andra sidan inducera plasmaproteiner på grund av blod luftkontakt. Att notera, van Oeveren et al. utvecklat en kul-ventil baserad slinga modell undvika luft inuti slingorna16. Detta lovande alternativ till den här presenterade loop modellen kan övervinna problemet med blod-luft gränssnittet, dock jämfört med den modell som presenteras här, trombocytadhesion är fortfarande högre för kulventilen baserad loop modell.
När det gäller den statiska kontrollen är det av not att glas självt har visat sig vara en potent aktivator av koagulatorsystemet37. I den presenterade setup, inkubation i en glasbägare (statisk kontroll) ledde dock inte till överdriven värdcell aktivering eller aktivering av koagulatoriska systemet jämfört med baslinjen nivåer direkt efter ritning av blodet. Sammanfattningsvis kan det vara bra att använda till exempel polypropylenrör, om den statiska kontrollen visar höga nivåer av aktivering.
Oavsett om det är en slinga baserad eller en pumpdriven modell, saknar dessa in vitro-modeller helt de autentiska biologiska interaktioner som huvudsakligen bidrar med ett intakt endotel, som är en idealisk blodkontaktyta. Logiken bakom denna fråga är mer uppenbar när en medicinteknisk produkt som en stent testas, vilket kan ge olika resultat, när det gäller aktivering och plasmaproteiner, under dess interaktion med blodkomponenter i närvaro av endotel. Detta förklarar vara en stor nackdel av alla diskuterade in vitro-system härma cirkulationssystemet. Därav, för att övervinna denna fråga, nya mikrofluidiska system som är helt täckta med endotel vinner enormt intresse, men ändå i jämförelse med loop modell som presenteras här, de är fortfarande begränsade för att rymma mindre blodvolymer och minimala flödeshastigheter38,39
Således drar vi slutsatsen att Chandler Loop modellen återstår att vara en robust modell för att genomföra standardiserade tester på blodet biokompatibilitet av vaskulär medicintekniska produkter inom området kardiovaskulär forskning.
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma till Ms Elena Denks för hennes tekniska hjälp.
5 ml tube, K3 EDTA | Sarstedt | 32332 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | Becton Dickinson BioSciences | 552843 | |
APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | |
BD LSR Fortessa II cell analyzer | Becton Dickinson | 647465 | |
BD Vacutainer Citrate Tubes | Becton Dickinson | 369714 | |
BD Vacutainer one-use holder | Becton Dickinson | 364815 | |
BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G | Becton Dickinson | 367282 | |
Beaker glass ROTILABO short 10 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X686.1 | |
Beaker glass ROTILABO short 50 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X688.1 | |
Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody | BioLegend | 328808 | |
Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303730 | |
Centrifuge ROTINA 420 | 420 R | Hettich Zentrifugen | 4701 | 4706 | |
Centrifuge tubes, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
CHC Super modified, 5mm PVC tubing | Corline Sweden | 1807-148 | Referred to as hepPVC tube |
Circular Precision Cutter | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 007-20 | |
Closing Unit (complete with tension bands) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 008-20 | |
Electric tape Scotch Super 33+ | VWR | MMMA331933 | |
ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6 | BioLegend | 430504 | |
ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a | BioLegend | 430204 | |
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 – 2,5 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000012 | |
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 – 10 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000020 | |
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 – 100 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000047 | |
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 – 1,000 µL, blue | Eppendorf AG | 3123000063 | |
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 – 200 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000055 | |
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 – 5 mL, violet | Eppendorf AG | 3123000071 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom | Corning BV | 352052 | |
Fetal bovine serum Gold Plus | Bio-Sell | FBS.GP.0500 | |
FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 367116 | |
Fluency plus stent 13.5 x 60 mm | Angiomed GmbH & Co | FVM14060 | |
Free Hemoglobin fHb Reagent | Bioanalytics GmbH | 004001-0250 | |
Gibco PBS Tablets | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
Gloves Vasco Nitril white L | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208437 | |
Gloves Vasco Nitril white M | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208429 | |
Glutaraldehyde 25% aequous solution | Sigma Aldrich | G6257-100ML | |
Heparin, 25.000 IE in 5 ml | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN 3862340 | |
Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit | Hölzel Diagnostika | abx253234 | |
Kodan tincture forte colourless | Schülke & Mayr GmbH | 104012 | |
Latex tube, ID 5 mm | Laborhandel24 GmbH | 305 0507 | |
Loop Stand | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 009-20 | |
Medimex venous tourniquet classic | ROESER Medical GmbH | 310005 | |
Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex | Tecan | TEC006418I | |
Microplate shaker PMS-1000i | VWR | 444-0041 | |
Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm | VWR | NALG8703-0508 | Referred to as PVC tube |
NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer | Medical Indicators | 2112-20 | |
Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated | BioLegend | 423501 | |
Osmium tetroxide solution | Fisher Scientific | 10256970 | |
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
PE anti-human CD16Antibody | BioLegend | 302008 | |
PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody | BioLegend | 304906 | |
Pipette controller, pipetus | VWR | 612-1874 | |
Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 – 5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5186480 | |
Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 – 10µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 9409410 | |
Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 – 200µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.870 | |
Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 – 1000µl blue | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.919 | |
PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit | Fisher Scientific | BMS269 | |
Probe stand ROTILABO combi | CARL ROTH | K082.1 | |
Rack for rotation unit (12 slots 3/8 '' with variable slot width) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 011-20 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
Reagent reservoirs | VWR | 613-1184 | |
Rotation Unit | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 010-20 | |
Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409320 | |
Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409331 | |
sc5b9 Human ELISA KIT | TECOmedicalGroup | A029 | |
Scalpel no 10 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG | Philips | n.a. | |
Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X715.1 | |
Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X714.1 | |
Semi-micro cuvette 1.6 ml | Sarstedt | 67.746 | |
Serological pipette 10.0 ml | Corning BV | 4488 | |
Serological pipette, 25.0 ml | Corning BV | 4489 | |
Serological pipette, 5.0 ml | Corning BV | 4487 | |
Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm | VWR | BURK8803-0812 | |
Sprout mini centrifuge | Biozym | 552034 | |
Stop Solution for TMB Substrate | BioLegend | 77316 | |
Swabs, sterile | Fuhrmann GmbH | 32055 | |
Syringe, 10 ml | Becton Dickinson | 300296 | |
Temperature controlled water basin | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 020-20 | |
tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | 10000730 | |
TMB Substrate Set | BioLegend | 421101 | |
Trillium PVC tube, 5 mm ID | Medtronic | 161100107100103 | Referred to as polyPVC tube |
Tween 20 | AppliChem | A4974,0250 | |
UV-Vis Spektrometer Lambda 2 | Perkin Elmer | 33539 | |
Vornado Mini Vortexer | Biozym | 55BV101-B-E | |
XN-3000 workstation blood analyzer | Sysmex Europe | n.a. | |
μ-CT Phoenix Nanotom S | GE Sensing & Inspection, Wunstorf, Germany | n.a. |