כימות של DNA ספציפי חזיר במחזור בדם של מודל xenotransplantation
Summary
בפרוטוקול זה, פריימרים ספציפיים porcine תוכננו, פלסמידים המכילים פלסמידים ספציפיים ל-DNA רסיס נבנו, ועיקולים סטנדרטיים עבור כמות הוקמו. באמצעות פריימרים ספציפיים למינים, cpsDNA היה לכמת על ידי qPCR במודלים השתלת תא חזיר לעכבר ומודלים השתלת תיקון עורק חזיר אל קוף.
Abstract
השתלת קסנו-השתלה היא שיטה אפשרית לטיפול בכישלון איברים. עם זאת, כיצד לפקח ביעילות על דחיית החיסון של xenotransplantation היא בעיה עבור רופאים וחוקרים. כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה כדי לפקח על דחייה חיסונית במודלים של השתלת תאי חזיר לעכבר ומודלים להשתלת תיקון עורק חזיר לקוף. במחזור הדנ”א הוא סמן ביולוגי לא פולשני לנזק לאיברים. במחקר זה, במחזור DNA ספציפי לחזיר (cpsDNA) היה במעקב במהלך דחיית xenograft על ידי PCR בזמן אמת כמותית (qPCR). בפרוטוקול זה, פריימרים ספציפיים porcine תוכננו, פלסמידים המכילים פלסמידים ספציפיים ל-DNA רסיס נבנו, ועיקולים סטנדרטיים עבור כמות הוקמו. פריימרים ספציפיים למינים שימשו לאחר מכן לכמת cpsDNA על ידי qPCR במודלים השתלת תא חזיר לעכבר ומודלים השתלת תיקון עורק חזיר אל קוף. הערך של שיטה זו מצביע על כך שניתן להשתמש בה כשיטה פשוטה, נוחה, בעלות נמוכה ופחות פולשנית כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation.
Introduction
כשל איברים הוא אחד הגורמים העיקרייםלמוות 1. השתלת תאים, רקמות ואיברים היא דרך יעילה לטיפול אי ספיקתאיברים 2. אף על פי כן, המחסור באיברים תורמים מגביל את היישום הקליני שלשיטה זו 3,4. מחקרים הראו כי חזירים יכולים לשמש כמקור פוטנציאלי של איברים אנושיים להשתלהקלינית 5,6. עם זאת, השתלת איברים בין מינים עומדת בפני דחייה חיסונית מסוכנת. לכן, זה קריטי כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation. כיום, ניטור קליני של דחייה חיסונית תלוי בעיקר סימנים ותסמינים של המטופל, כמו גם בדיקות מעבדה (למשל, ביופסיה, ניתוח חיסוני,ואולטרסאונד) 7,8,9. עם זאת, שיטות ניטור אלה יש חסרונות רבים. הסימנים והתסמינים של דחייה חיסונית בחולים מופיעיםבדרך כלל מאוחר 10, אשר אינו מועיל גילוי מוקדם והתערבות מוקדמת; ביופסיה יש את החיסרון שללהיות פולשנית 11, וזה לא קל לחולים לקבל; ניתוח חיסוני חסר רגישות או ספציפיות, אולטרסאונד הוא עזר ויקר. לכן, דחוף למצוא שיטה יעילה ונוחה כדי לפקח על הדחייה החיסונית.
מחזור DNA הוא סוג extracellular של DNA נמצא בדם. מנדל ומטאיס12 דיווחו לראשונה על נוכחות של דנ”א במחזור בדם היקפי בשנת 1948. בתנאים פיזיולוגיים נורמליים, במחזור ה-DNA בדם של אנשים בריאים הוא נמוך יחסית בבסיס. עם זאת, בכמה פתולוגיות, כגון גידולים, אוטם שריר הלב, מחלות אוטואימוניות, ודחיית השתלה, רמת ה-DNA במחזור בדם יכול להיות גדל באופןמשמעותי 13,14 בשל שחרור מסיבי של DNA במחזור שנגרם על ידי אפופטוזיס ונמק. המקור של ה-DNA במחזור קשור אפופטוזיס ונמק15, אשר אופייניים של דחיית xenograft16.
במחזור DNA הוכח להיות סמן ביולוגי פולשנית לגילויסרטן 17,18,19. רצף גבוה של דנ”א במחזור נגזר תורם הוא אמין לזיהוי דחייה לאחר השתלתאיברים 20,21. עם זאת, שיטה זו דורשת ריכוז גבוה ואיכות של דנ”א שחולץ. דרישות ה-DNA בנוסף לעלות הגבוהה וצריכת זמן להפוך שיטה זו לבלתי זכאית לשימוש קליני שגרתי. ניתן לכמת במדויק את ה-DNA הנגזר מתורם על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qPCR), שהוא גם ספציפי וגם רגיש. לכן, כימות ה-DNA במחזור porcine על ידי qPCR היא שיטה אפשרית כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation. זה פחות פולשני, רגיש מאוד וספציפי, בעלות נמוכה וחיסכון בזמן. חזירים בני אדם נפרדים גנטית עם רצפים גנומיים שונים לגמרי(איור 1). לכן, במחזור DNA porcine יכול להשתחרר לתוך הדם של הנמען לאחר השתלת קסנו בגלל דחיית קסנו. CpsDNA יכול להיות בדיוק לכמת על ידי qPCR עם פריימרים ספציפיים למינים בדם של הנמען. בעבר, הוכחנו את הרציונל והיתכנות של cpsDNA כסמן ביולוגי עבור xenotransplantation22,23. כאן, אנו חושפים טיפים ופרטים ניסיוניים נוספים. הניסוי מורכב מהצעדים הבאים. ראשית, פריימרים ספציפיים porcine תוכננו, ו-DNA גנומי היה מבודד, אשר שימשו כדי לאמת את הייחודיות של פריימרים על ידי PCR רגיל. שנית, בניית העקומה הסטנדרטית של cpsDNA וביוד cpsDNA מהדם המדגם. לבסוף, ה-DNA הספציפי לחזיר במחזור היה מכמת באמצעות qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
כימות הדי.אן.איי במחזור ה-DNA מייצג גישה אפשרית כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation. גדי ואח ‘24 מצא כי תוכן DNA נגזר תורם (ddcfDNA) בדם של חולים עם דחייה חריפה היה גבוה באופן משמעותי מזה של חולים ללא דחייה. מחקרים אלה מראים כי ddcfDNA עשוי להיות סמן ביולוגי נפוץ לניטור נזק שתל איברים. ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתכנית המחקר ודם המרכזית הלאומית של סין (2017YFC1103704), קרן שנג’ן למדע וטכנולוגיה (JCYJ20170817172116272), קרנות מיוחדות לבניית בתי חולים ברמה גבוהה בגואנגדונג מחוז (2019), פרויקט סנמינג לרפואה בשנזן (SZSM201412020), קרן לבניית משמעת רפואית ברמה גבוהה של שנזן (2016031638), קרן שנג’ן לבריאות ותכנון משפחה הוועדה (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).
Materials
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit Ⅰ | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
- Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
- Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
- Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
- Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
- Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
- Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
- Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
- Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
- Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
- Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
- Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
- Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
- Wagner, J. Free DNA–new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
- Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
- De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
- Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
- Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
- Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).
