異種移植モデルの血液中の循環性豚特異的DNAの定量化
Summary
本プロトコルでは、ブタ特異的プライマーを設計し、プラスミド含有ブタ特異的DNA断片を構築し、定量のための標準的な曲線を確立した。種特異的プライマーを用いて、cpsDNAを、豚からマウスへの細胞移植モデルおよびブタからサルへの動脈パッチ移植モデルにおいてqPCRによって定量化した。
Abstract
異種移植は、臓器不全を治療するための実行可能な方法である。しかし、異種移植の免疫拒絶反応を効果的に監視する方法は、医師や研究者にとって問題です。本稿では、豚からマウスへの細胞移植モデルおよびサルからサルへの動脈パッチ移植モデルにおける免疫拒絶反応をモニタリングする、簡単で効果的な方法を説明する。循環DNAは、臓器損傷のための潜在的に非侵襲的なバイオマーカーです。本研究では、循環ブタ特異的DNA(cpsDNA)を、定量リアルタイムPCR(qPCR)による異種移植片拒絶反応中にモニタリングした。本プロトコルでは、ブタ特異的プライマーを設計し、プラスミド含有ブタ特異的DNA断片を構築し、定量のための標準的な曲線を確立した。次に、ブタからマウスへの細胞移植モデルおよび豚からサルへの動脈パッチ移植モデルにおいて、種特異的プライマーを使用してqPCRによってcpsDNAを定量化した。この方法の値は、異種移植の免疫拒絶反応を監視するための簡便で、便利で低コストで、侵襲性の低い方法として使用できることを示唆している。
Introduction
臓器不全は死の主な原因の1つである。細胞、組織、臓器の移植は、臓器不全2を治療する有効な方法である。それにもかかわらず、ドナー臓器の不足は、この方法の臨床応用を制限する 3,4.研究は、豚が臨床移植のための人間の臓器の潜在的な供給源として使用することができることを示しています 5,6.しかし、クロス種臓器移植は危険な免疫拒絶反応に直面している。したがって、異種移植の免疫拒絶反応を監視することが重要です。現在、免疫拒絶反応の臨床モニタリングは、主に患者の徴候および症状、ならびに実験室試験(例えば、生検、免疫生物化学分析、および超音波)7、8、9に依存する。ただし、これらの監視方法には多くの欠点があります。患者の免疫拒絶反応の徴候と症状は通常10年後半に現れるが、これは早期発見と早期介入を助長しない。生検は、患者が受け入れるのは容易ではない侵襲的な11の欠点を有する。免疫生物化学分析は感度や特異性を欠き、超音波は補助的で高価です。したがって、免疫拒絶反応を監視する効果的かつ便利な方法を見つけることが急務である。
循環DNAは、血液中に見られる細胞外タイプのDNAです。マンデルとメタイス12は、1948年に末梢血中の循環DNAの存在を最初に報告した。正常な生理学的条件下では、健常者の血液中の循環DNAはベースラインにおいて比較的低い。しかし、腫瘍、心筋梗塞、自己免疫疾患、移植拒絶反応などのいくつかの病態では、アポトーシスおよび壊死によって引き起こされる循環DNAの大量放出により、血液中の循環DNAのレベルが13,14に有意に増加する可能性がある。循環DNAの起源は、異種移植片拒絶反応16の特徴であるアポトーシスおよび壊死15と関連している。
循環DNAは、癌17、18、19を検出するための低侵襲バイオマーカーであることが証明されている。ドナー由来循環DNAの高いスループットシーケンシングは、臓器移植20,21の後の拒絶反応の検出に対して信頼できる。しかし、この方法では、高濃度の抽出DNAの品質が必要です。高いコストおよび時間消費に加えてDNAの条件は、この方法は、日常的な臨床使用のために不適格になります。ドナー由来の循環DNAは、特異的かつ感度の高い定量リアルタイムPCR(qPCR)によって正確に定量することができます。従って、qPCRによるブタ循環DNAの定量化は、異種移植の免疫拒絶反応をモニタリングする実現可能な方法である。これは、侵襲性が低く、高感度で特定の、低コストで時間を節約します。豚と人間は、遺伝的に全く異なるゲノム配列と分離されている(図1)。したがって、循環性ブタDNAは、異種拒絶反応のためにレシピエントの血液異種移植後に放出され得る。CpsDNAは、レシピエントの血液中の種特異的プライマーを用いてqPCRによって正確に定量することができる。これまで、我々は異種移植22,23のバイオマーカーとしてのcpsDNAの根拠と実現可能性を実証した。ここでは、より実験的なヒントと詳細を開示します。実験は、次の手順で構成されます。まず、ブタ特異的プライマーを設計し、ゲノムDNAを単離し、通常PCRによりプライマーの特異性を検証するために使用した。第二に、cpsDNAの標準曲線を構築し、サンプル血液からcpsDNAを単離する。最後に、循環するブタ特異的DNAをqPCRを用いて定量した。
Protocol
Representative Results
Discussion
ブタ循環DNAを定量化することは、異種移植の免疫拒絶反応を監視する実現可能なアプローチを表す。Gadi et al.24 は、急性拒絶反応を有する患者の血液中のドナー由来循環DNA(ddcfDNA)含有量が拒絶反応のない患者のそれよりも有意に高いことを発見した。これらの研究は、ddcfDNAが臓器移植片の損傷を監視するための一般的なバイオマーカーである可能性があることを示唆してい?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家主要R&Dプログラム(2017YFC1103704)、深セン科学技術財団(JCYJ20170817081717172116272)、広東省の高等病院建設のための特別基金からの助成金によって支えられました (2019年)、深センのサンミング医学プロジェクト(SZSM201412020)、深セン高レベル医療規律建設基金(2016031638)、深セン健康家族計画委員会(SZXJ2017021)、SZXJ2018059)。
Materials
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit Ⅰ | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
- Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
- Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
- Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
- Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
- Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
- Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
- Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
- Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
- Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
- Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
- Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
- Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
- Wagner, J. Free DNA–new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
- Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
- De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
- Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
- Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
- Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).
