Quantification de l’ADN spécifique du porc circulant dans le sang d’un modèle de xénotransplantation
Summary
Dans ce protocole, des amorces spécifiques de porcin ont été conçues, des fragments spécifiques d’ADN de porcine contenant des plasmides ont été construits, et des courbes standard pour la quantitation ont été établies. À l’aide d’amorces spécifiques aux espèces, cpsDNA a été quantifié par qPCR dans des modèles de transplantation de cellules de porc à souris et des modèles de transplantation de patchs d’artère de porc à singe.
Abstract
La xénotransplantation est une méthode réalisable pour traiter l’insuffisance des organes. Cependant, comment surveiller efficacement le rejet immunitaire de la xénotransplantation est un problème pour les médecins et les chercheurs. Ce manuscrit décrit une méthode simple et efficace pour surveiller le rejet immunitaire dans les modèles de transplantation de cellules de porc à souris et les modèles de transplantation de patch d’artère de porc à singe. L’ADN circulant est un biomarqueur potentiellement non invasif pour les dommages aux organes. Dans cette étude, l’ADN pigo-spécifique circulant (cpsDNA) a été surveillé pendant le rejet de xénogreffe par PCR quantitatif en temps réel (qPCR). Dans ce protocole, des amorces spécifiques de porcin ont été conçues, des fragments spécifiques d’ADN de porcine contenant des plasmides ont été construits, et des courbes standard pour la quantitation ont été établies. Des amorces spécifiques aux espèces ont ensuite été utilisées pour quantifier la cpsDNA par qPCR dans des modèles de transplantation cellulaire de porc à souris et des modèles de transplantation de patchs d’artère de porc à singe. La valeur de cette méthode suggère qu’elle peut être utilisée comme méthode simple, pratique, peu coûteux et moins invasive pour surveiller le rejet immunitaire de la xénotransplantation.
Introduction
La défaillance des organes est l’une des principales causes dedécès 1. La transplantation de cellules, de tissus et d’organes est un moyen efficace de traiter l’insuffisance organique2. Néanmoins, la pénurie d’organes donneurs limite l’application clinique de cetteméthode 3,4. Des études ont montré que les porcs peuvent être utilisés comme source potentielle d’organes humains pour la transplantationclinique 5,6. Cependant, la transplantation d’organes inter-espèces fait face à un rejet immunitaire dangereux. Par conséquent, il est crucial de surveiller le rejet immunitaire de la xénotransplantation. À l’heure actuelle, la surveillance clinique du rejet immunitaire dépend principalement des signes et symptômes du patient, ainsi que des tests de laboratoire (p. ex., biopsie, analyse immunobiochimique et échographie)7,8,9. Toutefois, ces méthodes de surveillance ont de nombreux inconvénients. Les signes et les symptômes du rejet immunitaire chez les patients apparaissent habituellement à la finde 10, ce qui n’est pas propice à la détection précoce et l’intervention précoce; biopsie a l’inconvénient d’être invasive11, ce qui n’est pas facile pour les patients à accepter; l’analyse immunobiochimique manque de sensibilité ou de spécificité, et l’échographie est auxiliaire et coûteuse. Par conséquent, il est urgent de trouver une méthode efficace et pratique pour surveiller le rejet immunitaire.
L’ADN circulant est un type extracellulaire d’ADN trouvé dans le sang. Mandel et Metais12 ont signalé pour la première fois la présence d’ADN circulant dans le sang périphérique en 1948. Dans des conditions physiologiques normales, l’ADN circulant dans le sang des personnes en bonne santé est relativement faible à la ligne de base. Cependant, dans quelques pathologies, telles que des tumeurs, l’infarctus du myocarde, les maladies auto-immunes, et le rejet de greffe, le niveau de l’ADN circulant dans le sang peutêtre sensiblement augmenté 13,14 dû à la libération massive de l’ADN circulant provoqué par l’apoptose et la nécrose. L’origine de l’ADN circulant est associée à l’apoptose et à la nécrose15,qui sont caractéristiques du rejet de xénogreffe16.
Il a été prouvé que l’ADN circulant est un biomarqueur mini-invasif pour détecter les cancers17,18,19. Le séquençage par voie élevée de l’ADN circulant dérivé du donneur est fiable pour la détection du rejet après transplantationd’organe 20,21. Cependant, cette méthode exige une concentration élevée et la qualité de l’ADN extrait. Les exigences en matière d’ADN, en plus du coût élevé et de la consommation de temps, rendent cette méthode inadmissible à une utilisation clinique de routine. L’ADN circulant dérivé du donneur peut être quantifié avec précision par pcr quantitatif en temps réel (QPCR), qui est à la fois spécifique et sensible. Par conséquent, la quantification de l’ADN circulant porcin par qPCR est une méthode faisable pour surveiller le rejet immunitaire de la xénotransplantation. Il s’agit d’un gain de temps moins invasif, hautement sensible et spécifique, peu coûteux et moins coûteux. Les porcs et les êtres humains sont génétiquement séparés avec des séquences génomiques très différentes (Figure 1). Par conséquent, l’ADN porcin circulant peut être libéré dans le sang du destinataire post-xénotransplantation en raison du xéno-rejet. CpsDNA pourrait être précisément quantifié par qPCR avec des amorces spécifiques aux espèces dans le sang du receveur. Auparavant, nous avons démontré la justification et la faisabilité de cpsDNA en tant que biomarqueur pour la xénotransplantation22,23. Ici, nous divulguons plus de conseils expérimentaux et de détails. L’expérience se compose des étapes suivantes. Tout d’abord, des amorces spécifiques de porcine ont été conçues, et l’ADN génomique a été isolé, qui ont été utilisés pour vérifier la spécificité des amorce par PCR régulier. Deuxièmement, la construction de la courbe standard de cpsDNA et l’isolement de cpsDNA à partir du sang échantillonné. Enfin, l’ADN spécifique au porc en circulation a été quantifié à l’aide de qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantifier l’ADN circulant porcin représente une approche réalisable pour surveiller le rejet immunitaire de la xénotransplantation. Gadi et coll.24 ont constaté que la teneur en ADN circulant (DdcfDNA) dérivée du donneur dans le sang des patients présentant un rejet aigu était significativement plus élevée que celle des patients sans rejet. Ces études suggèrent que le ddcfDNA puisse être un biomarqueur commun pour surveiller des dommages de greffe d’organe. Ces dernières années…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par des subventions du National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), de la Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), des fonds spéciaux pour la construction d’hôpitaux de haut niveau à Guangd province de Sanming (2019), Projet sanming de médecine à Shenzhen (SZSM201412020), Fonds pour la construction de discipline médicale de haut niveau de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).
Materials
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit Ⅰ | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
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