Analisando a rede de α-Actinin em Cardiomiócitos derivados do iPSC humano usando microscopia de localização de molécula única

Summary

A formação de uma rede de sarcomere adequada é importante para o amadurecimento dos cardiomiócitos derivados do iPSC. Apresentamos uma abordagem baseada em super resolução que permite a avaliação quantitativa da maturação estrutural dos cardiomiócitos derivados de células-tronco, para melhorar as condições culturais que promovem o desenvolvimento cardíaco.

Abstract

A maturação dos cardiomiócitos derivados do iPSC é uma questão crítica para sua aplicação em terapia regenerativa, testes medicamentosos e modelagem de doenças. Apesar do desenvolvimento de protocolos de diferenciação múltiplos, a geração de cardiomiócitos iPSC semelhantes a um fenótipo semelhante a um adulto permanece desafiadora. Um aspecto importante da maturação dos cardiomiócitos envolve a formação de uma rede de sarcomere bem organizada para garantir alta capacidade de contração. Aqui, apresentamos uma abordagem baseada em super resolução para análise semi-quantitativa da rede α-actinina em cardiomiócitos. Utilizando microscopia de localização fotoativada foi realizada uma comparação do comprimento do sarcomere e da espessura do disco z de cardiomiócitos derivados do iPSC e células cardíacas isoladas do tecido neonatal. Ao mesmo tempo, demonstramos a importância das condições adequadas de imagem para obter dados confiáveis. Nossos resultados mostram que este método é adequado para monitorar quantitativamente a maturidade estrutural das células cardíacas com alta resolução espacial, permitindo a detecção de até mesmo alterações sutis da organização sarcomere.

Introduction

Doenças cardiovasculares (DCV) como infarto do miocárdio ou cardiomiopatia continuam sendo a principal causa de morte no mundo ocidental¹. Como o coração humano possui apenas baixa capacidade regenerativa, há necessidade de estratégias para promover a recuperação dos DCV. Isso inclui terapias de substituição celular para repor cardiomiócitos perdidos (CM), bem como o desenvolvimento de novos medicamentos anti-arrítmicos para intervenção farmacêutica eficiente e segura. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) têm se mostrado uma fonte celular promissora para a geração ilimitada de CM humano in vitro, adequado para terapias regenerativas, modelagem de doenças e para o desenvolvimento de ensaios de rastreamento de medicamentos^2,,3,4.

Embora existam muitos protocolos de diferenciação cardíaca diferentes, o CM derivado do iPSC ainda carece de certos aspectos fenotípicos e funcionais que impedem a aplicação in vitro e in vivo^5,6. Além das alterações eletrofisiológicas, metabólicas e moleculares, o processo de maturação cardíaca envolve a organização estrutural dos sarcomeres, que são as unidades fundamentais necessárias para a geração de força e contração celular⁷. Enquanto os CMs adultos exibem um aparelho contratil bem organizado, os CMs derivados do iPSC comumente demonstram filamentos sarcomere desaranjados, associados a uma capacidade de contração reduzida e dinâmica de contração alterada^8,,9. Em contraste com cm maduros que mostram padrão de contração uniaxial, as estruturas desorientadas em CM imaturos resultam em uma contração radial de toda a célula ou promovem o aparecimento dos pontos focais de contração^9,,10.

Para melhorar a maturação cardíaca, foram aplicadas múltiplas abordagens, incluindo métodos de cultura celular 3D, estimulação elétrica e mecânica, bem como o uso de matrizes extracelulares imitando condições in vivo^11,,12,,13. Para avaliar o sucesso e a eficiência dessas diferentes condições culturais, são necessárias técnicas para monitorar e estimar o grau de maturação estrutural do CM iPSC, por exemplo, por técnicas microscópicas. Em contraste com a imagem confocal convencional, a resolução em caso de microscopia de localização fotoativada (PALM) é aproximadamente 10x maior. Essa técnica, por sua vez, permite uma análise mais precisa, detectando até mesmo alterações sutis das estruturas celulares¹⁴. Considerando a alta resolução da imagem baseada em PALM, o objetivo geral deste método foi a avaliação microscópica da maturidade sarcomere em CMs derivados do iPSC por determinação precisa da espessura do disco z e do comprimento do sarcomere. Em estudos anteriores, essas características estruturais têm se mostrado parâmetros adequados para avaliar a maturidade cardíaca¹⁵. Por exemplo, iPSC-CM doente sem distrofina de comprimento total exibe comprimento reduzido de sarcomere e largura de banda z quando comparado com células do tipo selvagem¹⁶. Da mesma forma, o comprimento dos sarcomeres individuais foi medido para investigar o impacto das pistas topográficas no desenvolvimento cardíaco¹⁶. Assim, aplicamos essa abordagem para avaliar a maturação estrutural da rede sarcomere no iPSC-CM, medindo quantitativamente o comprimento do sarcomere e a espessura do disco Z.

Protocol

Todas as etapas deste protocolo envolvendo camundongos neonatais e adultos foram realizadas de acordo com as diretrizes éticas para o cuidado animal do Centro Médico da Universidade de Rostock. 1. Cultivo e dissociação de cardiomiócitos derivados do iPSC Diferencie hiPSC-CMs por 25 dias usando um método de monocamadas 2D, conforme descrito anteriormente17. Dissociação pré-inaque de médio a 37 °C e suporte temperatura média a ambiente.</li…

Representative Results

Para a estimativa do grau de maturação estrutural de CM, adulto neonatal, adulto totalmente maduro e CM iPSC foram inicialmente rotulados como CM com anticorpo α-actinin para visualizar a rede de sarcomere. Após a aquisição do PALM, as imagens foram reconstruídas e a espessura do disco z foi medida por meio de um software de processamento de imagem baseado em plugin para a detecção automática da largura dos filamentos individuais. O comprimento de Sarcomere foi calculado medindo a distância entre dois picos de…

Discussion

A geração de CM in vitro derivada do iPSC funcional é importante para terapias regenerativas, modelagem de doenças e desenvolvimento de plataformas de rastreamento de medicamentos. No entanto, a maturidade insuficiente desses CM é um grande obstáculo na pesquisa cardiovascular²⁰. Nesse sentido, são necessárias técnicas de imagem de alta resolução que permitam o monitoramento do estado de maturação estrutural do CM derivado do iPSC. Ao mesmo tempo, a microscopia de super resolução po…

Materials

human iPSC cell line	Takara	Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom	ibidi	80827
0.5ml eppendorf tube	Eppendorf	30121023
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit	Stem Cell Technologies	05025
Catalase	Sigma Aldrich	C40-1G
Cyclooctatetraene	Sigma Aldrich	138924-1G
Cysteamine	Sigma Aldrich	30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher	14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647	Thermo Fisher	A-21237
Fiji image processing software (Image J)
Glucose	Carl Roth	X997.2
Hydrochloric acid	Sigma Aldrich	H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system	Zeiss
Paraformaldehyde	Merck	8187150100
Pyranose oxidase	Sigma Aldrich	P4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53]	Abcam	ab9465
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S7653
sterile water	Carl Roth	3255.1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Trizma base	Sigma Aldrich	T1503
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	63689