Een neonatale beeldvorming model van gram-negatieve bacteriële sepsis
Summary
Infectie van neonatale muizen met bioluminescente E. coli O1:K1:H7 resulteert in een septische infectie met significante longontsteking en longpathologie. Hier beschrijven we procedures om neonatale sepsis te modelleren en verder te bestuderen met behulp van longitudinale intravitale beeldvorming parallel met de opsomsoming van systemische bacteriële lasten, ontstekingsprofilering en longsentopathologie.
Abstract
Neonaten hebben een verhoogd risico op bacteriële sepsis als gevolg van het unieke immuunsysteem profiel dat ze vertonen in de eerste maanden van het leven. We hebben een protocol opgesteld voor het bestuderen van de pathogenese van E. coli O1:K1:H7, een serotype dat verantwoordelijk is voor hoge sterftecijfers bij pasgeborenen. Onze methode maakt gebruik van intravital beeldvorming van neonatale pups op verschillende tijdstippen tijdens de progressie van infectie. Deze beeldvorming, parallel met het meten van bacteriën in het bloed, ontstekingsprofilering en weefsel histopathologie, betekent een rigoureuze benadering van het begrijpen van infectiedynamica tijdens sepsis. In het huidige rapport modelleren we twee infectieuze entculums voor de vergelijking van bacteriële lasten en de ernst van de ziekte. We vinden dat subscapulaire infectie leidt tot verspreide infectie door 10 uur na infectie. Tegen 24 uur, infectie van luminescente E. coli was overvloedig in het bloed, longen, en andere perifere weefsels. Expressie van inflammatoire cytokinen in de longen is significant bij 24 uur, en dit wordt gevolgd door cellulaire infiltratie en bewijs van weefselschade die toeneemt met infectieuze dosis. Intravital imaging heeft wel een aantal beperkingen. Dit omvat een lichtgevende signaaldrempel en enkele complicaties die kunnen ontstaan bij neonaten tijdens anesthesie. Ondanks enkele beperkingen, vinden we dat onze infectie model biedt een inzicht voor het begrijpen van longitudinale infectie dynamiek tijdens neonatale murine sepsis, die niet grondig is onderzocht tot op heden. We verwachten dat dit model ook kan worden aangepast aan andere kritische bacteriële infecties te bestuderen tijdens het vroege leven.
Introduction
Bacteriële sepsis is een belangrijke zorg voor neonaten die een uniek immuunprofiel vertonen in de eerste dagen van het leven dat geen adequate bescherming biedt tegen infectie1. Neonatale sepsis blijft een belangrijke Amerikaanse gezondheidszorg probleem goed voor meer dan 75.000 gevallen per jaar in de VS alleenal 2. Om deze infecties grondig te bestuderen, zijn nieuwe diermodellen nodig die aspecten van de menselijke ziekte samenvatten. We hebben een neonatale muis infectie model met behulp van Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli is de tweede belangrijkste oorzaak van neonatale sepsis in de VS, maar verantwoordelijk voor de meerderheid van de sepsis-geassocieerde mortaliteit4,5. Echter, het is de belangrijkste oorzaak wanneer pre-term en zeer laag geboortegewicht (VLBW) baby’s worden beschouwd als onafhankelijk5. Het K1-serotype wordt het vaakst geassocieerd met invasieve bloedbaaninfecties en meningitis bij neonaten6,7. Momenteel zijn er geen andere behandelingsopties dan antibiotica en ondersteunende zorg. Ondertussen blijven de tarieven van antibioticaresistentie stijgen voor veel pathogene bacteriën, met sommige stammen van E. coli resistent tegen een veelheid van antibiotica vaak gebruikt in behandeling8. Het is dus absoluut noodzakelijk dat we methoden blijven genereren om de mechanismen van sepsis en de gastheerrespons in neonaten te bestuderen. Deze resultaten kunnen helpen om te verbeteren op de huidige behandelingen en infectie resultaten.
De immuuntoestand van neonaten wordt gekenmerkt door zowel fenotypische als functionele verschillen in vergelijking met volwassenen. Zo is aangetoond dat verhoogde niveaus van ontstekingsremmende en regulerende cytokinen, zoals interleukine (IL)-10 en IL-27, worden geproduceerd door door navelstrengbloed afgeleide macrofagen en zijn zij op grotere niveaus aanwezig in het serum van murine neonaten9,10,11. Dit komt overeen met lagere niveaus van IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 en TNF-α die vaak worden gerapporteerd vanuit neonatale cellen in vergelijking met volwassen tegenhangers10. Bovendien is het neonatale immuunsysteem scheef in de richting van een Th2 en regelgevende T-celrespons in vergelijking met volwassenen12. Verhoogde aantallen neutrofielen, T-cellen, B-cellen, NK-cellen en monocyten zijn ook aanwezig in neonaten, maar met aanzienlijke functionele beperkingen. Dit omvat defecten in expressie van celoppervlakmarkeringen en antigeenpresentatie die onrijpheid13,14,15suggereren . Bovendien, neonatale neutrofielen zijn aanzienlijk tekort in hun vermogen om te migreren naar chemotactische factoren16. Myeloïde-afgeleide suppressor cellen (MDSCs) zijn ook gevonden op verhoogde niveaus in neonaten en onlangs aangetoond dat een bron van IL-2711. MDC’s zijn zeer onderdrukkend in de richting van T-cellen17. Gezamenlijk tonen deze gegevens beperkingen aan in neonatale immuniteit die de gevoeligheid voor infectie verhogen.
Om de progressie van de bacteriële last te bestuderen en beschermende gastheer immuunreacties te ontleden tijdens neonatale sepsis, hebben we een nieuw infectiemodel ontwikkeld. Neonatale muizen op dagen 3-4 van het leven zijn moeilijk te injecteren in de intraperitoneale ruimte of staartader. In ons model worden dag 3 of 4 pups het bacteriële entmateriaal of PBS onderhuids toegediend in het scapulaire gebied. Een systemische infectie ontwikkelt zich en met behulp van luminescente E. coli O1:K1:H7, kunnen we langswaarts beeld individuele neonatale muizen om de verspreide bacteriële last in perifere weefsels te volgen. Dit is het eerste gerapporteerde model dat intravital beeldvorming gebruikt om de kinetiek van verspreiding van bacteriën tijdens sepsis bij murine neonaten te begrijpen3.
Hier beschrijven we een protocol om septische E. coli-infecties bij neonatale muizen3te induceren. We beschrijven hoe het bacteriële entmateriaal voor injectie moet worden voorbereid en hoe weefsel kan worden geoogst voor de beoordeling van pathologie, het meten van ontstekingsmarkers door genexpressieanalyse en opsomring van de bacteriële last. Daarnaast wordt ook het gebruik van luminescente E. coli voor intravitale beeldvorming van geïnfecteerde neonaten en kwantificering van bacteriële doden door neonatale immuuncellen beschreven. Deze protocollen kunnen ook worden aangepast om andere belangrijke bacteriële infecties in neonaten te bestuderen. De hier gepresenteerde gegevens vertegenwoordigen een algemene nieuwe benadering van het begrijpen van infectiedynamiek in een vertaalbaar neonatale sepsismodel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ons subscapulaire infectiemodel voor het induceren van bacteriële sepsis bij neonatale muizen is een nieuwe methode om de longitudinale verspreiding van bacteriële pathogenen in realtime te bestuderen. Intravital imaging biedt de mogelijkheid om bacteriële verspreiding in real time te verkennen in neonaten. Dit is van cruciaal belang om de kinetiek van bacteriële verspreiding te begrijpen en de respons en schade van de gastheer in de juiste fase van de ziekte verder te bestuderen. Muispups krijgen een onderhuidse, su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door institutionele fondsen aan C.M.R.
Materials
| 1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
| Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
| Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
| E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
| IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
| IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
| LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
| EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
| Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
| Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
References
- Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
- Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).
- Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
- Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013 (2016).
- Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
- Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
- Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , 69 (2012).
- Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
- Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
- Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune responses in neonates. Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).
- Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
- Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
- Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
- Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
- Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
- Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
- Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
- National Research Council. . Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
- Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, 299-310 (2011).
- Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528 (2015).
- Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
- Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
- Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
- Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
- Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).
