グラム陰性細菌敗血症の新生児画像モデル
Summary
新生児マウスの生物発光 性大腸菌 O1:K1:H7感染は、著しい肺炎症および肺病理を伴う敗血症感染をもたらす。ここでは、全身性細菌の負担の列挙、炎症プロファイリング、肺組織病理学と並行して縦方向の生体内イメージングを用いて新生児敗血症をモデル化し、さらに研究する手順について述べた。
Abstract
新生児は、生後数ヶ月で表示されるユニークな免疫プロファイルのために細菌敗血症のリスクが高くなります。私たちは、新生児の高い死亡率を担う血清型である 大腸菌 O1:K1:H7の病因を研究するためのプロトコルを確立しました。我々の方法は、感染の進行時に異なる時点で新生児の出生時の生体内画像を利用する。このイメージングは、血液中の細菌の測定、炎症プロファイリング、および組織組織組織病理学によって平行して、敗血症中の感染ダイナミクスを理解するための厳格なアプローチを意味する。現在の報告書では、細菌の負担と疾患の重症度を比較するための2つの感染性接種をモデル化する。我々は、皮下感染が感染後10時間までに感染を広めることにつながることを発見した。24時間までに、血液、肺、およびその他の末梢組織に発光 性大腸菌 の感染が豊富であった。肺の炎症性サイトカインの発現は24時間で有意であり、その後に細胞浸潤および感染性用量で増加する組織損傷の証拠が続く。インビタルイメージングには、いくつかの制限があります。これには、発光シグナル閾値と麻酔中に新生児で生じる可能性のあるいくつかの合併症が含まれます。いくつかの制限にもかかわらず、私たちの感染モデルは、これまで徹底的に調べられていない新生児マウス敗血症中の縦方向感染ダイナミクスを理解するための洞察を提供することがわかりました。このモデルは、初期の間に他の重要な細菌感染を研究するためにも適応できると期待しています。
Introduction
細菌敗血症は、感染からの十分な保護を提供しない生後の最初の日にユニークな免疫プロファイルを示す新生児にとって重要な懸念事項である1。新生児敗血症は、米国だけで毎年75,000例以上を占める米国の重大な医療問題であり続けています2.これらの感染症を深く研究するためには、ヒト疾患の側面を再現する新しい動物モデルが必要である。我々は、Eシェリヒア大腸菌、O1:K1:H73を用いて新生児マウス感染モデルを確立した。大腸菌は、米国における新生児敗血症の第2の主要な原因であるが、敗血症関連死亡率4、5の大部分を占める。しかし、それは、前期および非常に低い出生体重(VLBW)の赤ちゃんが独立して5と考えられる主な原因である。K1血清型は、新生児6,7における侵襲性血流感染および髄膜炎に最も頻繁に関連している。現在、抗生物質や支援ケア以外の治療法はありません。一方、多くの病原性細菌に対する抗生物質耐性の割合は上昇し続け、治療8で一般的に使用される多数の抗生物質に耐性のある大腸菌の株もある。したがって、新生児における敗血症のメカニズムと宿主応答を研究する方法を作り続けることが不可欠です。これらの結果は、現在の治療と感染結果を改善するのに役立ちます.
新生児の免疫状態は、成人と比較して、触語と機能的な違いの両方によって特徴付けられる。例えば、インターロイキン(IL)-10およびIL-27のような抗炎症および調節性サイトカインの上昇レベルは、臍帯血由来のマクロファージによって産生され、マウス新生児9、10、11の血清中でより大きなレベルで存在することが示されている。これは、成人の対応物10と比較して新生児細胞から頻繁に報告されるIFN-α、IFN-ɣ、IL-12、およびTNF-αの低レベルと一致する。さらに、新生児免疫系は、成人12と比較してTh2および調節性T細胞応答に向かって歪んでいる。好中球、T細胞、B細胞、NK細胞、および単球の増加数も新生児に存在するが、著しい機能的障害を有する。これには、細胞表面マーカーの発現における欠陥および非成熟性13、14、15を示唆する抗原提示が含まれる。さらに、新生児好中球は、化学戦術因子16に移行する能力が著しく欠損している。骨髄由来のサプレッサー細胞(MDSC)は、新生児の上昇レベルでも見られ、最近IL-2711の供給源であることが示されている。MDSC は T 細胞17に対して非常に抑制性が高い。総称して、これらのデータは、感染に対する感受性の増加に役立つ新生児免疫の限界を示している。
新生児敗血症時の細菌の負担の進行と保護宿主免疫応答の解剖を研究するために、我々は新しい感染モデルを開発した。新生児マウスは、3〜4日目の生命において、腹腔内腔または尾静脈に注入することが困難である。我々のモデルでは、3日目または4日目の子犬は、細菌の接種またはPBSを皮下領域に投与する。全身感染が発症し、発光性大腸菌O1:K1:H7を用いて、個々の新生児マウスを縦断的に画像化し、末梢組織における播種された細菌負担に従うことができる。これは、マウス新生児3における敗血症時の細菌の普及の動態を理解するために、生体内画像化を利用する最初の報告されたモデルである。
ここでは、新生児マウス3における敗血症性大腸菌感染症を誘導するプロトコルについて説明する。注射用の細菌接種を調製する方法、病理評価のための組織の採取方法、遺伝子発現解析による炎症マーカーの測定、細菌負担の列挙方法について説明する。また、新生児免疫細胞による細菌殺死の活性化および細菌の定量化に対する発光性大腸菌の使用についても説明する。これらのプロトコルはまた、新生児における他の重要な細菌感染を研究するために適応され得る。ここに示すデータは、翻訳可能な新生児敗血症モデルにおける感染ダイナミクスを理解するための全体的な新しいアプローチを表しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
新生児マウスで細菌敗血症を誘導する当社の肩甲膜感染モデルは、細菌病原体の縦方向の広がりをリアルタイムで研究する新しい方法です。インビタルイメージングは、新生児における細菌の播体拡散をリアルタイムで探索する機会を提供します。これは、細菌の普及の運動学を理解し、病気の適切な段階で宿主の応答および損傷をさらに研究するために重要である。マウスの子犬は、細菌?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事は、C.M.Rへの機関資金によって支えられた。
Materials
| 1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
| Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
| Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
| E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
| IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
| IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
| LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
| EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
| Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
| Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
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