En neonatal bildemodell av gram-negativ bakteriell sepsis
Summary
Infeksjon av neonatal mus med bioluminescerende E. coli O1:K1:H7 resulterer i en septisk infeksjon med betydelig lungebetennelse og lungepatologi. Her beskriver vi prosedyrer for å modellere og videre studere neonatal sepsis ved hjelp av langsgående intravital avbildning parallelt med opplisting av systemiske bakterielle byrder, inflammatorisk profilering og lunge histopatologi.
Abstract
Nyfødte har økt risiko for bakteriell sepsis på grunn av den unike immunprofilen de viser i de første månedene av livet. Vi har etablert en protokoll for å studere patogenesen av E. coli O1:K1:H7, en serotype som er ansvarlig for høy dødelighet hos nyfødte. Vår metode benytter intravital avbildning av neonatale valper på forskjellige tidspunkter under infeksjonsprogresjonen. Denne avbildningen, parallelt med måling av bakterier i blodet, inflammatorisk profilering og vev histopatologi, betyr en streng tilnærming til å forstå infeksjonsdynamikk under sepsis. I den nåværende rapporten modellerer vi to smittsomme inoculums for sammenligning av bakterielle byrder og alvorlighetsgraden av sykdommen. Vi finner at subscapular infeksjon fører til spredt infeksjon med 10 h etter infeksjon. Ved 24 timer var infeksjon av selvlysende E. coli rikelig i blod, lunger og annet perifert vev. Uttrykk for inflammatoriske cytokiner i lungene er signifikant ved 24 timer, og dette etterfølges av cellulær infiltrasjon og tegn på vevsskade som øker med smittsom dose. Intravital bildebehandling har noen begrensninger. Dette inkluderer en selvlysende signalterskel og noen komplikasjoner som kan oppstå med nyfødte under anestesi. Til tross for noen begrensninger finner vi at vår infeksjonsmodell gir et innblikk for å forstå langsgående infeksjonsdynamikk under neonatal murine sepsis, som ikke har blitt grundig undersøkt til dags dato. Vi forventer at denne modellen også kan tilpasses for å studere andre kritiske bakterielle infeksjoner tidlig i livet.
Introduction
Bakteriell sepsis er en betydelig bekymring for nyfødte som viser en unik immunprofil i de første dagene av livet som ikke gir tilstrekkelig beskyttelse mot infeksjon1. Neonatal sepsis fortsetter å være et betydelig amerikansk helseproblem som står for mer enn 75.000 tilfeller årlig i USA alene2. For å studere disse infeksjonene i dybden, er det nødvendig med nye dyremodeller som rekafulerer aspekter ved menneskelig sykdom. Vi har etablert en neonatal mus infeksjon modell ved hjelp av Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli er den nest ledende årsaken til neonatal sepsis i USA, men ansvarlig for flertallet av sepsis-assosiertdødelighet 4,5. Det er imidlertid den ledende årsaken når pre-term og svært lav fødselsvekt (VLBW) babyer anses uavhengig5. K1 serotypen er oftest forbundet med invasive blodbanen infeksjoner og meningitt i nyfødte6,7. For tiden er det ingen andre behandlingsalternativer utover antibiotika og støttende omsorg. I mellomtiden fortsetter forekomsten av antibiotikaresistens å stige for mange patogene bakterier, med noen stammer av E. coli som er resistente mot en rekke antibiotika som vanligvis brukes i behandling8. Dermed er det viktig at vi fortsetter å generere metoder for å studere mekanismene for sepsis og vertsresponsen i nyfødte. Disse resultatene kan bidra til å forbedre på dagens behandlinger og infeksjonsutfall.
Immuntilstanden til nyfødte er preget av både fenotypiske og funksjonelle forskjeller sammenlignet med voksne. For eksempel har forhøyede nivåer av antiinflammatoriske og regulatoriske cytokiner, som interleukin (IL) -10 og IL-27, vist seg å være produsert av ledningen blod-avledede makrofager og er til stede på større nivåer i serum av murine nyfødte9,10,11. Dette er i samsvar med lavere nivåer av IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 og TNF-α som ofte rapporteres fra nyfødte celler sammenlignet med voksne kolleger10. I tillegg er det nyfødte immunsystemet skjevt mot en Th2 og regulatorisk T-cellerespons sammenlignet med voksne12. Forhøyede antall nøytrofiler, T-celler, B-celler, NK-celler og monocytter er også tilstede i nyfødte, men med betydelige funksjonsnedsettering. Dette inkluderer defekter i uttrykk for celleoverflatemarkører og antigenpresentasjon som tyder på umodenhet13,14,15. I tillegg er neonatale nøytrofiler betydelig mangelfulle i deres evne til å migrere til chemotaktiskefaktorer 16. Myeloid-avledede suppressorceller (MDSCer) finnes også ved forhøyede nivåer i nyfødte og nylig vist seg å være en kilde til IL-2711. MDSCer er svært undertrykkende mot T-celler17. Samlet viser disse dataene begrensninger i neonatal immunitet som gir økt mottakelighet for infeksjon.
For å studere utviklingen av bakteriell byrde og dissekere beskyttende verts immunresponser under neonatal sepsis, har vi utviklet en ny infeksjonsmodell. Neonatal mus på dager 3-4 av livet er vanskelig å injisere i intraperitoneal plass eller halevene. I vår modell administreres dag 3 eller 4 valper bakterieinkulum eller PBS subkutant inn i scapular-regionen. En systemisk infeksjon utvikler seg og bruker selvlysende E. coli O1:K1:H7, vi kan langsgående bilde individuelle neonatal mus for å følge den spredte bakterielle byrden i perifert vev. Dette er den første rapporterte modellen som bruker intravital avbildning for å forstå kinetikken til spredning av bakterier under sepsis hos murine nyfødte3.
Her beskriver vi en protokoll for å indusere septiske E. coli-infeksjoner hos neonatale mus3. Vi beskriver hvordan du forbereder bakteriell inokutum til injeksjon, og hvordan du høster vev for vurdering av patologi, måling av inflammatoriske markører ved genuttrykksanalyse og opplisting av bakteriebyrden. I tillegg er bruk av selvlysende E. coli for intravital avbildning av infiserte nyfødte og kvantifisering av bakteriell drap av neonatale immunceller også beskrevet. Disse protokollene kan også tilpasses for å studere andre viktige bakterielle infeksjoner i nyfødte. Dataene som presenteres her representerer en generell ny tilnærming til å forstå infeksjonsdynamikk i en oversettelig neonatal sepsismodell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår subscapular infeksjon modell for å indusere bakteriell sepsis i neonatal mus er en ny metode for å studere langsgående spredning av bakterielle patogener i sanntid. Intravital bildebehandling gir mulighet til å utforske bakteriell formidling i sanntid i nyfødte. Dette er avgjørende for å forstå kinetikken til bakteriell formidling og å studere vertsresponsen og skaden i riktig sykdomsfase. Musevalper administreres en subkutan, subscapular injeksjon av bakteriell inoculum. Denne injeksjonsteknikken er enkler…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av institusjonelle midler til .M.R.
Materials
| 1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
| Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
| Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
| E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
| IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
| IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
| LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
| EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
| Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
| Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
References
- Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
- Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).
- Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
- Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013 (2016).
- Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
- Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
- Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , 69 (2012).
- Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
- Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
- Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune responses in neonates. Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).
- Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
- Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
- Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
- Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
- Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
- Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
- Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
- National Research Council. . Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
- Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, 299-310 (2011).
- Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528 (2015).
- Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
- Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
- Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
- Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
- Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).
