En neonatal bildmodell av gramnegativ bakteriell sepsis

Summary

Infektion av neonatal möss med bioluminescerande E. coli O1:K1:H7 resulterar i en septisk infektion med betydande pulmonell inflammation och lung patologi. Här beskriver vi förfaranden för att modellera och ytterligare studera neonatal sepsis med hjälp av längsgående intravital imaging parallellt med uppräkning av systematiska bakteriebördor, inflammatorisk profilering och lung histopatologi.

Abstract

Nyfödda löper en ökad risk för bakteriell sepsis på grund av den unika immunprofil de visar under de första månaderna av livet. Vi har upprättat ett protokoll för att studera patogenesen av E. coli O1:K1:H7, en serotyp som ansvarar för hög dödlighet i nyfödda. Vår metod utnyttjar intravital imaging av neonatal pups vid olika tidpunkter under utvecklingen av infektion. Denna avbildning, parallellt med mätning av bakterier i blodet, inflammatorisk profilering och vävnad histopatologi, innebär en rigorös strategi för att förstå infektionsdynamik under sepsis. I den aktuella rapporten modellerar vi två infektiösa inokulat för jämförelse av bakteriebelastningar och sjukdomens svårighetsgrad. Vi finner att subscapular infektion leder till spridas infektion genom 10 h post-infektion. Genom 24 h, infektion av luminescent E. coli var rikligt i blodet, lungor och andra perifera vävnader. Expression av inflammatoriska cytokiner i lungorna är signifikant vid 24 h, och detta följs av cellulär infiltration och bevis på vävnadsskador som ökar med smittsam dos. Intravital avbildning har vissa begränsningar. Detta inkluderar en luminescent signal tröskel och några komplikationer som kan uppstå med nyfödda under anestesi. Trots vissa begränsningar, finner vi att vår infektion modell erbjuder en insikt för att förstå longitudinella infektion dynamik under neonatal murine sepsis, som inte har undersökts noggrant hittills. Vi förväntar oss att denna modell också kan anpassas för att studera andra kritiska bakterieinfektioner under det tidiga livet.

Introduction

Bakteriell sepsis är ett betydande bekymmer för nyfödda som uppvisar en unik immunprofil under de första dagarna av livet som inte ger tillräckligt skydd mot infektion¹. Neonatal sepsis fortsätter att vara en betydande amerikanska hälso-och sjukvårdsproblem står för större än 75.000 fall årligen i USA ensam². För att studera dessa infektioner på djupet krävs nya djurmodeller som rekapitulerar aspekter av sjukdomar hos människor. Vi har etablerat en neonatal mus infektion modell med hjälp av Escherichia coli, O1:K1:H7³. E. coli är den näst vanligaste orsaken till neonatal sepsis i USA, men ansvarig för majoriteten av sepsis-associerade dödlighet^4,5. Det är dock den främsta orsaken när pre-term och mycket låg födelsevikt (VLBW) spädbarn anses självständigt⁵. Den K1 serotyp är oftast förknippas med invasiva blodomloppet infektioner och hjärnhinneinflammation hos nyfödda^6,7. För närvarande finns det inga andra behandlingsalternativ utöver antibiotika och stödjande vård. Samtidigt fortsätter andelen antibiotikaresistens att stiga för många patogena bakterier, med vissa stammar av E. coli resistenta mot en mängd antibiotika som vanligen används vid behandling⁸. Således är det absolut nödvändigt att vi fortsätter att generera metoder för att studera mekanismerna för sepsis och värdsvaret hos nyfödda. Dessa resultat kan bidra till att förbättra nuvarande behandlingar och infektionsresultat.

Immuntillståndet hos nyfödda kännetecknas av både fenotypiska och funktionella skillnader jämfört med vuxna. Till exempel, förhöjda nivåer av antiinflammatoriska och regulatoriska cytokiner, såsom interleukin (IL)-10 och IL-27, har visat sig produceras av navelsträngen blod-härledda makrofager och är närvarande på högre nivåer i serum av murine nyfödda^9,10,11. Detta är förenligt med lägre nivåer av IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 och TNF-α som ofta rapporteras från neonatalceller jämfört med vuxna motsvarigheter¹⁰. Dessutom är neonatal immunsystemet skev mot en Th2 och reglerande T cell svar jämfört med vuxna¹². Förhöjda antal neutrofiler, T-celler, B-celler, NK-celler och monocyter finns också i nyfödda, men med betydande funktionsnedsättningar. Detta inkluderar defekter i uttryck av cellytan markörer och antigen presentation som tyder på omognad^13,14,15. Dessutom är neonatal neutrofiler väsentligt bristfälliga i sin förmåga att migrera till chemotactic faktorer¹⁶. Myeloida-härledda suppressorceller (MDSCs) finns också på förhöjda nivåer hos nyfödda och nyligen visat sig vara en källa till IL-27¹¹. MDC är mycket suppressiv mot T-celler¹⁷. Tillsammans visar dessa data begränsningar i neonatal immunitet som lånar ut till ökad mottaglighet för infektion.

För att studera utvecklingen av bakteriebördan och dissekera skyddande värd immunsvar under neonatal sepsis, har vi utvecklat en ny infektion modell. Neonatal möss vid dag 3-4 i livet är svåra att injicera i intraperitoneal utrymme eller svans ven. I vår modell, dag 3 eller 4 ungar administreras den bakteriella inokulat eller PBS subkutant in i scapular regionen. En systemisk infektion utvecklas och med hjälp av självlysande E. coli O1:K1:H7, kan vi längsgående bild enskilda neonatal möss att följa den spridas bakteriebördan i perifera vävnader. Detta är den första rapporterade modellen att utnyttja intravital avbildning för att förstå kinetiken av spridning av bakterier under sepsis i murine nyfödda³.

Här beskriver vi ett protokoll för att inducera septiska E. coli infektioner i neonatal möss³. Vi beskriver hur man förbereder bakteriell inokulat för injektion, och hur man skörda vävnad för bedömning av patologi, mätning av inflammatoriska markörer genom genuttryck analys och uppräkning av bakteriebördan. Dessutom beskrivs också användning av luminescent E. coli för intravital avbildning av infekterade nyfödda och kvantifiering av bakteriellt dödande av neonatal immunceller. Dessa protokoll kan också anpassas för att studera andra viktiga bakteriella infektioner hos nyfödda. De data som presenteras här representerar en övergripande roman strategi för att förstå infektion dynamik i en översättlig neonatal sepsis modell.

Protocol

Alla förfaranden godkändes av West Virginia Institutionskommittéer för djurvård och användning och genomfördes i enlighet med rekommendationerna från Vägledning för vård och användning av laboratoriedjur av National Research Council18. 1. Beredning av bakteriell inokulat Strimma en Tryptic soja agar (TSA) platta med en inokukulerande slinga för isolering av en enda koloni från en frys lager av E. coli O1:K1:H7-lux som uttrycker …

Representative Results

Detta protokoll inducerad bakteriell sepsis i neonatal möss, och vi använde längsgående intravital imaging, uppräkning av bakterier i blodet, histologiska bedömningar av patologi och inflammatoriska cytokin uttryck profiler för att studera sjukdomsförloppet. Tecken på sjuklighet observerades hos neonatal pups infekterade med både låg (~ 2 x 106 CFUs) och hög (~ 7 x 106 CFUs) inokulat av E.coli över tid. Pups så som mottagen den belyst mer inoculum förevisat mer framträdande …

Discussion

Vår subscapular infektion modell för att inducera bakteriell sepsis i neonatal möss är en ny metod för att studera den longitudinella spridningen av bakteriella patogener i realtid. Intravital avbildning ger möjlighet att utforska bakteriespridning i realtid hos nyfödda. Detta är avgörande för att förstå kinetiken vid bakteriespridning och att ytterligare studera värdresponsen och -skadan vid lämplig fas av sjukdom. Musungar administreras en subkutan, subscapular injektion av bakteriell inokulat. Denna inje…

Materials

1 mL Insulin Syringe	Coviden	1188128012	Inoculum or PBS injection
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	89370-094	Histopathology
ACK Lysis Buffer	Gibco	LSA1049201	Bacterial clearance assay
Animal Tattoo Ink Paste	Ketchum	KI1482039	Animal identification
Animal Tattoo Ink Green Paste	Ketchum	KI1471039	Animal identification
Anti-Ly-6B.2 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-100-781	Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase)	N/A	N/A	Constructed in-house at WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit	Omega Bio-tek	R6812	RNA extration
DPBS, 1X	Corning	21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar	Becton, Dickinson and Company	236950	Bacterial growth
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
iQ Supermix	Bio-Rad	1708860	Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708891	cDNA synthesis
Isolation Buffer	Miltenyi Biotec	N/A	Bacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software	Perkin Elmer	N/A	Intravital imaging
LB Broth, Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500	Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket)	Greiner Bio-one	542 040	Cell strainer
SpectraMax iD3	Molecular Devices	N/A	Plate reader
Pellet Pestle Motor	Grainger	6HAZ6	Tissue homogenization
Polypropylene Pellet Pestles	Grainger	6HAY5	Tissue homogenization
Prime Thermal Cycler	Techne	3PRIMEBASE/02	cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP)	Molecular Research Center	TR 118	RNA extration