يتميز تنشيط Ser/Thr kinase AURKA متعدد الوظائف بفسفرته الذاتية على Thr288. يمكن لمجسات الفلورسنت التي تعتمد على FRET التمييز بين حالاتها غير النشطة والمنشطة. هنا ، نوضح بعض الاستراتيجيات لهندسة المسبار ، جنبا إلى جنب مع بروتوكول FRET السريع لمتابعة تنشيط كيناز في جميع أنحاء الانقسام.
غالبا ما تتميز السرطانات الظهارية بالتعبير المفرط عن Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA هو بروتين متعدد الوظائف ينشط عند الفسفرة الذاتية على Thr288. تبلغ وفرة AURKA ذروتها في الانقسام ، حيث تتحكم في استقرار ودقة المغزل الانقسامي ، والكفاءة الكلية للانقسام. على الرغم من تميزه بشكل جيد على المستوى الهيكلي ، إلا أنه لا يوجد رصد متسق لتنشيط AURKA طوال دورة الخلية. يتمثل الحل المحتمل في استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية لنقل الطاقة بالرنين (FRET) المشفرة وراثيا من Förster للحصول على نظرة ثاقبة على الفسفرة الذاتية ل AURKA بدقة مكانية زمانية كافية. هنا ، نصف بروتوكولا لهندسة أجهزة الاستشعار الحيوية FRET للكشف عن الفسفرة الذاتية Thr288 ، وكيفية اتباع هذا التعديل أثناء الانقسام. أولا ، نقدم نظرة عامة على أزواج FRET المحتملة من المانحين / المتقبلين ، ونعرض طرق الاستنساخ والإدراج الممكنة لأجهزة الاستشعار الحيوية AURKA FRET في خلايا الثدييات. بعد ذلك ، نقدم تحليلا خطوة بخطوة لقياسات FRET السريعة بواسطة الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة (FLIM) على إعداد مصمم خصيصا. ومع ذلك، ينطبق هذا البروتوكول أيضا على الحلول التجارية البديلة المتاحة. نختتم بالنظر في أنسب ضوابط FRET لجهاز استشعار حيوي قائم على AURKA ، وبتسليط الضوء على التحسينات المستقبلية المحتملة لزيادة حساسية هذه الأداة.
Aurora kinase A/AURKA هو كيناز سيرين/ثريونين متعدد الوظائف، ينشط طوال دورة الخلية وفي مقصورات تحت خلوية مختلفة1. إن فهم تنشيطه المكاني الصدغي الواسع مهم بشكل خاص في السرطان ، حيث غالبا ما يتم التعبير عن AURKA بشكل مفرط في الأورام الخبيثة الظهارية والدموية ، حيث يظهر المرضى استجابة ضعيفة للعلاجات المتاحة حاليا2.
كشفت الدراسات الهيكلية أن AURKA يخضع لخطوتين للتحول من كيناز غير نشط إلى كيناز نشط. أولا ، يغير الفوسفور الذاتي ل Thr288 تكوين الجيب الحركي للكيناز وينشطه3،4،5،6. تزيد هذه الخطوة من النشاط الحفاز ل AURKA في الخلايا البشرية وفي Xenopus laevis3,6,7 ، مما يؤدي إلى تهيئة الكيناز للنشاط الكامل. بمجرد تنشيطه ، يؤدي تفاعل AURKA مع البروتين المستهدف ل Xklp2 (TPX2) إلى تغيير تشكيلي ثان5. يسمح هذا التعديل الإضافي ل AURKA بالوصول إلى النشاط الأنزيمي الكامل نحو ركائزه في الخلية5,8,9,10.
على مدى ما يقرب من عقدين من الزمان ، تم الحصول على رؤى حول تنشيط ونشاط AURKA بشكل رئيسي من خلال مزيج من النهج الكيميائية الحيوية. وتشمل هذه الكشف عن Thr288 المفسفرة في الخلايا أو في الجسم الحي كسمة مميزة لتنشيط AURKA ، والتحليلات البلورية ، وفي المختبر أو في مقايسات كيناز السليلو للتحقيق في نشاط AURKA1. ومع ذلك، فإن الحل المكاني الزماني لهذه النهج ضعيف أو غائب، وكانت هناك حاجة إلى حلول جديدة لتوسيع المعرفة بديناميات هذين الحدثين.
سهل تطوير مجسات الفلورسنت في السنوات القليلة الماضية مراقبة AURKA في الخلايا الحية ، مما سمح بمتابعة تنشيطه بدقة مكانية زمانية أكبر. تعتمد أجهزة الاستشعار الأكثر تحديدا ل AURKA التي تم تطويرها حتى الآن على مبدأ FRET (نقل الطاقة بالرنين من Förster)11 للتمييز بين AURKA غير النشطة والنشطة. كان أول مستشعر تم تطويره هو مستشعر حيوي قائم على الركيزة لنشاط كيناز AURKA. تتكون أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على الركيزة من تسلسل حموضة أمينية قصير يستهدفه كيناز معين للفسفرة ، ويتم إدخاله داخل زوج FRET المانح / المتقبل ومجال ربط يتعرف على بقايا المفسفرة ، مما يساعد على طي المستشعر الحيوي لعملية FRET فعالة12. وفي حالة AURKA، تم إدراج جزء من 14 حمضا أمينيا من KIF2C مستهدفا بالفسفرة بين زوج من المتبرعين/المتقبلين CFP-YFP13. ومع ذلك ، فإن هذا المستشعر له بعض العيوب الرئيسية. أولا ، يمكن استهداف تسلسل KIF2C المستخدم في هذا المسبار بواسطة AURKA و kinase AURKB المرتبط ارتباطا وثيقا ، مما يقلل من خصوصية هذا المستشعر الحيوي. ثانيا ، يعتمد المستشعر على الكيناز الداخلي للفسفرة. لذلك ، يمكن أن تكون كفاءة FRET غير قابلة للكشف أو غير كبيرة إذا كانت كميات الكيناز محدودة (على سبيل المثال ، في المقصورات دون الخلوية أو مراحل دورة الخلية). للتغلب على هذه القيود ، تم إنشاء فئة جديدة من أجهزة استشعار AURKA تعرف باسم “أجهزة الاستشعار التوافقية”. في هذه المجسات ، تم إدخال التسلسل الكامل الطول ل AURKA داخل الفلوروفور المانح في المحطة N ، والفلوروفور المتقبل في المحطة C. يقدم AURKA غير النشط تشكيلا “مفتوحا” ، والذي يجلب N- و C-termini من كيناز بعيدا عن بعضهما البعض. مع هذه المسافة بين تيرميني (> 10 نانومتر) ، يكون زوج المتبرع / المستقبل في تكوين غير متساهل ل FRET. على العكس من ذلك ، تعتمد AURKA ذاتية الفوسفوريل تشكيلا “مغلقا” ، مع وجود اثنين من البروتين termini واثنين من الفلوروفورات على مقربة. وقد تبين أن هذا يسمح ب FRET بين المتبرع والمتقبل ، والذي يمكن قياسه باستخدام الاختلافات في عمر المتبرع14,15. هذه التحقيقات تقدم العديد من المزايا. أولا ، يتم ترميزها وراثيا ، ويمكن استخدامها لتحل محل الكيناز الداخلي في الخلية. ثانيا ، ينقذون الأنماط الظاهرية الناجمة عن ضربة قاضية من AURKA ، مما يشير إلى أنها وظيفية في الخلية. ثالثا ، تسمح بمتابعة تنشيط الكيناز في مقصورات تحت خلوية مختلفة وطوال دورة الخلية. اكتشفت المجسات تنشيط AURKA في المواقع التي يعرف فيها تنشيط الكيناز (أي السنتروسومات والمغزل الانقسامي) ، وشاركت أيضا في اكتشاف تنشيط AURKA في الميتوكوندريا16. وأخيرا، سمحت هذه المستشعرات بإجراء فحوصات عالية المحتوى استنادا إلى FRET/FLIM، حيث تم استخدام التغييرات التوافقية ل AURKA لتحديد المثبطات الدوائية الجديدة17.
في هذا العمل ، نصف إجراء لتصور تنشيط AURKA في الخلايا المستزرعة. أولا ، سنقدم نظرة ثاقبة على أزواج الفلوروفور المحتملة ل FRET. سيتم اختيار زوج المانح / المتقبل الأنسب وفقا لإعداد المجهر المتاح ، أو تطبيق معين في اتجاه المصب مثل FRET18,19 متعدد الإرسال. بعد ذلك ، نقترح خط أنابيب لاستكشاف سلوك المستشعر الحيوي (المستشعرات الحيوية) المختار في إعداد مجهر FRET / FLIM السريع. سيمتد خط الأنابيب هذا من زراعة الخلايا وإجراءات المزامنة إلى اكتساب FLIM وتحليل البيانات. أخيرا ، سنناقش المزايا المحتملة لهذا البروتوكول ، حيث يمكن تطبيق استراتيجية مماثلة لتصميم أجهزة الاستشعار الحيوية على كينازات أخرى ، ويمكن أيضا استخدامها مع أنظمة التصوير الأخرى القائمة على FRET.
أجهزة الاستشعار الحيوية FRET المشفرة وراثيا هي أدوات موثوقة لقياس تنشيط البروتينات المفردة أو مسارات الإشارات بأكملها41. على وجه الخصوص ، يشكل المستشعر الحيوي AURKA FRET طريقة تفضيلية لاستكشاف تنشيط الكيناز في الزمان والمكان. ومع ذلك ، تستحق بعض العناصر اهتماما خاصا عند تصميم أو تحسين جهاز استشعار حيوي FRET ، ليس فقط بشكل عام ولكن بشكل أكثر تحديدا ل AURKA.
أولا ، يمكن تكييف طبيعة والوضع النسبي لزوج FRET المانح / المتقبل لوظائف محددة لهذا الكيناز. يتم إثراء AURKA بشكل كبير في المغزل الانقسامي أثناء الانقسام ، ولكنه موجود طوال دورة الخلية وفي مواقع مختلفة دون الخلية (على سبيل المثال ، السنتروسومات ، النواة ، والميتوكوندريا)1,2. إذا كان من المقرر استخدام المستشعر الحيوي في مقصورات محددة مثل الميتوكوندريا ، والتي يمكن أن تصل إلى درجة الحموضة الحمضية ، فيجب اختيار زوج FRET غير الحساس للأس الهيدروجيني للمتبرع والمستقبل مثل mTurquoise2 / shadowG. علاوة على ذلك ، فإن وضع المتبرع FRET في المحطة C يمكن أن يسمح بتصور أفضل للمستشعر الحيوي في هذه المقصورة تحت الخلوية ، وربما حتى تحسين اكتشاف FRET بالنظر إلى أن AURKA N-terminus قد تبين أنه يشق جزئيا في الميتوكوندريا 16,42.
ثانيا ، تتطلب طريقة غير مستكشفة بعد لتحسين المستشعر الحيوي AURKA FRET تصميما أكثر دقة للروابط بين AURKA كاملة الطول وزوج المتبرع / المستقبل. ليس فقط المسافة بين زوج الفلورسنت ، ولكن أيضا خصائص الرابط نفسه تبين أنها عوامل رئيسية لتحسين كفاءة FRET43,44,45,46. في ضوء ذلك ، يمكن أن تكون زيادة صلابة أو مرونة الرابط إما ضارة بكفاءة FRET ، أو تزيد من تحسينها.
ثالثا ، من المعروف أن الإفراط في التعبير عن AURKA يؤدي إلى تشوهات المغزل الانقسامي في نسبة كبيرة من الخلايا2. سيكون من المثير للاهتمام مقارنة ΔLifetime التي تم الحصول عليها من خلال التعبير عن نفس بنية FRET تحت مروج قوي مثل الفيروس المضخم للخلايا (CMV) – أحد أكثر المروجين شيوعا الموجودين في ناقلات التعبير الثدييات – أو تحت تسلسل AURKA الأدنى للمروج (CTTCCGG) 14,47. وقد تبين سابقا أن هذا المروج ينقذ المغازل أحادية القطب أو متعددة الأقطاب التي تنشأ بعد ضربة قاضية للكيناز ، ولم يؤد استخدامه إلى اضطرابات دورة الخلية في حد ذاتها 14,47. على الرغم من أن FLIM غير حساس لمستويات التعبير عن البروتين والتركيزات النسبية في الخلية11 ، فإن الاستفادة من مقارنة شاملة بين المروجين على نفس إعداد المستشعر الحيوي من شأنه أن يوسع فهم مجموعة AURKA المنشطة في أي موقع معين. بالإضافة إلى ذلك ، سيوفر رؤى جديدة حول كيفية تغير تنشيط AURKA عند الإفراط في التعبير ، وهو أمر ذي صلة بنماذج السرطان الظهارية والدموية.
أخيرا ، يجب أيضا أخذ تطبيق FRET النهائي في الاعتبار. سيكون المنظور المستقبلي في مجال AURKA هو تجميع المستشعر الحيوي التوافقي كيناز مع مستشعر حيوي قائم على الركيزة. يتطلب تحليل سلوك FRET لاثنين من أجهزة الاستشعار الحيوية في وقت واحد – وهي عملية تعرف باسم FRET متعدد الإرسال – متقبلا مظلما على المستشعر الحيوي الأول لتجنب النزيف الطيفي في القناة المانحة الثانية. في سياق AURKA ، من شأن هذا أن يفتح منظورا جديدا مثيرا للكشف عن تنشيط الكيناز باستخدام المستشعر الحيوي الأول ، ونشاطه الأنزيمي نحو ركيزة معينة مع الركيزة الثانية. تسمح التطورات الأخيرة في تعدد الإرسال الآن بتجميع ما يصل إلى ثلاثة أجهزة استشعار حيوي في وقت واحد48. يمكن أن يمثل تطبيق طريقة مماثلة في سياق AURKA استراتيجية واعدة للغاية ليس فقط لاختبار تفاعل التنشيط والنشاط للكيناز ، ولكن أيضا لاستكشاف سلاسل إشارات AURKA بدقة مكانية زمانية غير مسبوقة.
في الختام ، FRET / FLIM هي طريقة مريحة لتعميق المعرفة حول نشاط البروتين. من ناحية ، فإنه يسمح بتصور توطين بروتين معين في الخلايا الحية ، وذلك بفضل مويتي فلوري واحد على الأقل. من ناحية أخرى ، يمكن أن يكشف عن التغيرات التوافقية للبروتين ، والتي يمكن أن تكون مفيدة في تنشيط البروتين و / أو النشاط. لذلك ، فإن أجهزة الاستشعار الحيوية FRET / FLIM و FRET التوافقية لديها القدرة على أن تصبح طرقا واسعة الانتشار لمتابعة مسارات الإشارات في الخلايا الحية ، ودقة مكانية زمانية رائعة.
The authors have nothing to disclose.
نشكر مهندسي مركز التصوير المجهري رين (MRic ، BIOSIT ، رين ، فرنسا) على المشورة والمساعدة ، وخاصة X. Pinson على القراءة النقدية للمخطوطة. MRic عضو في البنية التحتية الوطنية France-BioImaging التي تدعمها الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR-10-INBS-04). وحظي هذا العمل بدعم المركز الوطني للبحوث العلمية، ورابطة مكافحة السرطان لجان التعليم والفيلين، وكوت الدروع والفينيستير، ورابطة البحوث المناهضة للسرطان التابعة لمجموعة .B.
Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
LabTek | Nunc | 2515380 | |
Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |