A ativação do Ser/Thr kinase multifuncional AURKA é marcada por sua autofosforilação em Thr288. Sondas fluorescentes que dependem de FRET podem discriminar entre seus estados inativos e ativados. Aqui, ilustramos algumas estratégias para a engenharia de sondas, juntamente com um protocolo RÁPIDO DE FRET para acompanhar a ativação da quinase ao longo da mitose.
Os cânceres epiteliais são frequentemente marcados pela superexpressão da Aurora A/AURKA ser/thr quinase. AURKA é uma proteína multifuncional que se ativa em sua autofosforilação em Thr288. AURKA abundância picos em mitose, onde controla a estabilidade e a fidelidade do fuso mitotístico, e a eficiência geral da mitose. Embora bem caracterizado no nível estrutural, falta um monitoramento consistente da ativação da AURKA ao longo do ciclo celular. Uma possível solução consiste em usar biosensores de transferência de energia de ressonância (FRET) geneticamente codificados para obter insights sobre a autofosforilação da AURKA com resolução espostetemporal suficiente. Aqui, descrevemos um protocolo para projetar biosensores FRET detectando a autofosforilação de Thr288, e como seguir essa modificação durante a mitose. Primeiro, fornecemos uma visão geral dos possíveis pares FRET doadores/aceitadores, e mostramos possíveis métodos de clonagem e inserção de biosensores AURKA FRET em células de mamíferos. Em seguida, fornecemos uma análise passo-a-passo para medições rápidas de FRET por microscopia de imagem de vida fluorescência (FLIM) em uma configuração personalizada. No entanto, este protocolo também é aplicável a soluções comerciais alternativas disponíveis. Concluímos considerando os controles FRET mais adequados para um biosensor baseado em AURKA e destacando possíveis melhorias futuras para aumentar ainda mais a sensibilidade desta ferramenta.
Aurora quinase A/AURKA é uma quinase serina/threonina multifuncional, ativa em todo o ciclo celular e em diferentes compartimentos subcelulares1. Compreender sua ampla ativação esposteral é particularmente importante no câncer, uma vez que a AURKA é frequentemente superexpressa em malignidades epiteliais e hematológicas, com pacientes mostrando baixa receptividade às terapias atualmente disponíveis2.
Estudos estruturais revelaram que a AURKA passa por duas etapas para converter de uma quinase inativa para uma quinase ativa. Primeiro, a autofosforilação de Thr288 altera a conformação do bolso cinético da quinase e a ativa3,4,5,6. Esta etapa aumenta a atividade catalítica da AURKA em células humanas e em Xenopus laevis3,6,7, escorraçando a quinase para a atividade completa. Uma vez ativada, a interação da AURKA com a proteína de alvo para Xklp2 (TPX2) induz uma segunda alteração conformacional5. Esta nova modificação permite que a AURKA atinja atividade enzimática completa em direção aos seus substratos na célula5,8,9,10.
Durante quase duas décadas, insights sobre a ativação e atividade da AURKA foram obtidos principalmente através de uma combinação de abordagens bioquímicas. Estes incluem a detecção de Thr288 fosforilado em células ou in vivo como uma marca registrada da ativação aURKA, análises cristalográficas e ensaios in vitro ou em celulose quinase para sondar a atividade de AURKA1. No entanto, a resolução espesso dessas abordagens é ruim ou ausente, e novas soluções foram necessárias para ampliar o conhecimento da dinâmica desses dois eventos.
O desenvolvimento de sondas fluorescentes nos últimos anos facilitou o monitoramento da AURKA em células vivas, permitindo o seguinte de sua ativação com maior resolução espacial. Os sensores mais específicos para a AURKA desenvolvidos até agora contam com o princípio FRET (Förster’s Resonance Energy Transfer)11 para discriminar entre a AURKA inativa e ativa. O primeiro sensor desenvolvido foi um biosensor baseado em substrato de atividade de quinase AURKA. Os biosensores à base de substrato são constituídos por uma sequência aminoádica curta, alvo de uma dada quinase para fosforilação, e inseridos dentro de um par FRET doador/acceptnte e um domínio de ligação reconhecendo o resíduo fosforilado, que ajuda a dobrar o biosensor para um processo TRAT12 eficiente. No caso da AURKA, um fragmento de 14 aminoácidos de KIF2C alvo de fosforilação foi inserido entre um par de doadores/aceitadores CFP-YFP13. No entanto, este sensor tem algumas grandes desvantagens. Primeiro, a sequência KIF2C usada nesta sonda pode ser direcionada tanto pela AURKA quanto pela Quinase AURKB intimamente relacionada, diminuindo assim a especificidade deste biosensor. Em segundo lugar, o sensor conta com a quinase endógena para fosforilação. Portanto, a eficiência do FRET pode ser indetectável ou não significativa se as quantidades da quinase forem limitantes (por exemplo, em compartimentos subcelulares ou fases de ciclo celular). Para superar essas limitações, uma nova classe de sensor AURKA foi criada conhecida como “sensores conformacionais”. Nestas sondas, a sequência completa de AURKA foi inserida dentro de um fluoróforo doador no N-terminus, e um fluoróforo aceitor no C-terminus. A AURKA inativa apresenta uma conformação “aberta”, que afasta o N e c-termini da quinase um do outro. Com tal distância entre os dois termini (> 10 nm), o par doador/aceitor está em uma configuração não permissiva para FRET. Pelo contrário, a AURKA autofosforilada adota uma conformação “fechada”, com as duas proteínas termini e as duas fluoroforos próximas. Isso foi demonstrado para permitir o FRET entre o doador e o aceitor, que pode ser medido utilizando-se as variações na vida do doador14,15. Tais sondas apresentam várias vantagens. Primeiro, eles são geneticamente codificados, e eles podem ser usados para substituir a quinase endógena na célula. Em segundo lugar, eles resgatam os fenótipos induzidos pelo knockdown da AURKA, indicando que eles são funcionais na célula. Em terceiro lugar, permitem acompanhar a ativação da quinase em diferentes compartimentos subcelulares e ao longo do ciclo celular. As sondas detectaram a ativação da AURKA em locais onde a quinase é conhecida por ser ativada (ou seja, centrosos e o fuso mitotístico), e também participaram na descoberta da ativação da AURKA nas mitocôndrias16. Por último, esses sensores permitiram triagens de alto teor baseados em FRET/FLIM, onde as alterações conformais da AURKA foram usadas para identificar novos inibidores farmacológicos17.
No presente trabalho, descrevemos um procedimento para visualizar a ativação da AURKA em células cultivadas. Primeiro, vamos fazer uma visão sobre potenciais pares fluoróforos para fret. A escolha do par de doadores/aceitadores mais adequados será feita de acordo com a configuração disponível do microscópio, ou uma aplicação particular a jusante como multiplex FRET18,19. Em seguida, propomos um pipeline para explorar o comportamento do biosensor(s) escolhido em uma rápida configuração de microscópio FRET/FLIM. Este gasoduto se estenderá desde procedimentos de cultura celular e sincronização até aquisição e análise de dados da FLIM. Por último, discutiremos as vantagens potenciais deste protocolo, pois uma estratégia análoga para o design de biosensor poderia ser aplicada a outros quinases, e também pode ser usada com outros sistemas de imagem baseados em FRET.
Biosensores FRET codificados geneticamente são ferramentas confiáveis para medir a ativação de proteínas únicas ou de vias de sinalização inteiras41. Particularmente, o biosensor AURKA FRET constitui uma maneira preferencial de explorar a ativação da quinase no tempo e no espaço. No entanto, alguns elementos merecem atenção especial ao projetar ou otimizar um biosensor FRET, não apenas em termos gerais, mas mais especificamente para a AURKA.
Em primeiro lugar, a natureza e a posição relativa do par FRET doador/aceitador podem ser adaptadas para funções específicas desta quinase. Aurka é muito enriquecida no fuso mitotístico durante a mitose, mas está presente em todo o ciclo celular e em diferentes locais subcelulares (por exemplo, centrossários, núcleo e mitocôndrias)1,2. Se o biosensor for usado em compartimentos específicos como mitocôndrias, que podem atingir pH ácido, a escolha de um par FRET doador-aceitante insensível pH como mTurquoise2/shadowG deve ser feita. Além disso, colocar o doador DE FRET no C-terminus poderia permitir uma melhor visualização do biosensor neste compartimento subcelular, e potencialmente até mesmo otimizar a detecção de FRET, dado que a AURKA N-terminus foi demonstrada para cortar parcialmente em mitocôndrias16,42.
Em segundo lugar, uma maneira ainda inexplorada de otimizar o biosensor AURKA FRET exigiria um desenho mais cuidadoso dos linkers entre a AURKA de comprimento completo e o par doador/aceitor. Não apenas a distância entre o par fluorescente, mas também as propriedades do próprio linker mostraram-se fatores-chave para melhorar a eficiência do FRET43,44,45,46. Nesta luz, aumentar a rigidez ou a flexibilidade do linker pode ser prejudicial à eficiência da FRET, ou melhorá-la ainda mais.
Em terceiro lugar, sabe-se que a superexpressão da AURKA induz anormalidades do fuso mitotístico em uma proporção significativa de células2. Seria interessante comparar o ΔLifetime obtido expressando a mesma construção fret sob um forte promotor como o citomegalovírus (CMV) – um dos promotores mais comuns encontrados em vetores de expressão de mamíferos – ou sob a sequência de promotores mínimos AURKA (CTTCCGG)14,47. Este promotor foi previamente mostrado para resgatar fusos monopolar ou multipolares surgidos após a derrubada da quinase, e seu uso não induziu perturbações de ciclo celular por se14,47. Embora o FLIM seja insensível aos níveis de expressão proteica e concentrações relativas nas células11, beneficiar-se de uma comparação completa dos dois promotores na mesma configuração biosensora ampliaria a compreensão do pool de AURKA ativado em qualquer local. Além disso, forneceria novas informações sobre como a ativação da AURKA pode mudar após a superexpressão, o que é relevante para paradigmas epiteliais e hematológicos do câncer.
Por último, o aplicativo FRET a jusante também deve ser levado em conta. Uma perspectiva futura no campo da AURKA seria cumular o biosensor conformacional quinase com um biosensor baseado em substrato. Analisar o comportamento de FRET de dois biosensores simultaneamente – um processo conhecido como MULTIPLEX FRET – requer um aceitador escuro no primeiro biosensor para evitar sangramento espectral no segundo canal de doadores. No contexto da AURKA, isso abriria a nova perspectiva excitante de detectar a ativação da quinase com o primeiro biosensor, e sua atividade enzimática em direção a um determinado substrato com o segundo. Os recentes desenvolvimentos no multiplexing agora permitem acumular até três biosensores por vez48. Aplicar um método semelhante no contexto da AURKA poderia representar uma estratégia muito promissora não apenas para testar a interação ativa-atividade da quinase, mas também para explorar cascatas de sinalização AURKA com resolução espostetemporal sem precedentes.
Em conclusão, o FRET/FLIM é uma maneira conveniente de aprofundar o conhecimento sobre a atividade proteica. Por um lado, permite visualizar a localização de uma determinada proteína em células vivas, graças a pelo menos uma moiety fluorescente. Por outro lado, pode desvendar alterações conformais de proteínas, que podem ser informativas sobre ativação de proteínas e/ou atividade. Portanto, os biosensores FRET/FLIM e conformacionais da FRET têm o potencial de se tornarem métodos generalizados para seguir caminhos de sinalização em células vivas e com resolução espacial requintada.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos aos engenheiros do Centro de Imagens Microscopia-Rennes (MRic, BIOSIT, Rennes, França) por conselhos e ajuda, e particularmente X. Pinson pela leitura crítica do manuscrito. MRic é membro da infraestrutura nacional France-BioImaging apoiada pela Agência Nacional de Pesquisa francesa (ANR-10-INBS-04). Este trabalho foi apoiado pelo Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), pela Ligue Contre le Cancer Comités d’Ille et Vilaine, des Côtes d’Armor et du Finistère, e pela Association pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) para G.B.
Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
LabTek | Nunc | 2515380 | |
Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |