De activering van de multifunctionele Ser/Thr kinase AURKA wordt gekenmerkt door zijn autofosforylering op Thr288. Fluorescerende sondes die op FRET vertrouwen, kunnen onderscheid maken tussen de inactieve en geactiveerde toestanden. Hier illustreren we enkele strategieën voor sonde-engineering, samen met een snel FRET-protocol om de kinase-activering tijdens mitose te volgen.
Epitheliale kankers worden vaak gekenmerkt door de overexpressie van de Ser / Thr kinase Aurora A / AURKA. AURKA is een multifunctioneel eiwit dat wordt geactiveerd bij zijn autofosforylering op Thr288. AURKA-abundantie piekt in mitose, waar het de stabiliteit en de getrouwheid van de mitotische spil en de algehele efficiëntie van mitose regelt. Hoewel goed gekarakteriseerd op structureel niveau, ontbreekt een consistente monitoring van de activering van AURKA gedurende de celcyclus. Een mogelijke oplossing bestaat uit het gebruik van genetisch gecodeerde Förster’s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensoren om inzicht te krijgen in de autofosforylering van AURKA met voldoende spatiotemporale resolutie. Hier beschrijven we een protocol om FRET-biosensoren te ontwikkelen die Thr288-autofosforylering detecteren en hoe deze wijziging tijdens mitose kan worden gevolgd. Eerst geven we een overzicht van mogelijke donor/acceptor FRET-paren en tonen we mogelijke kloon- en insertiemethoden van AURKA FRET-biosensoren in zoogdiercellen. Vervolgens bieden we een stapsgewijze analyse voor snelle FRET-metingen door fluorescentielevende beeldvormingsmicroscopie (FLIM) op een op maat gemaakte opstelling. Dit protocol is echter ook van toepassing op alternatieve commerciële oplossingen die beschikbaar zijn. We sluiten af met het overwegen van de meest geschikte FRET-controles voor een op AURKA gebaseerde biosensor en door mogelijke toekomstige verbeteringen te benadrukken om de gevoeligheid van deze tool verder te vergroten.
Aurora kinase A/AURKA is een multifunctioneel serine/threonine kinase, actief gedurende de celcyclus en in verschillende subcellulaire compartimenten1. Het begrijpen van de brede spatiotemporale activering is vooral belangrijk bij kanker, omdat AURKA vaak overexpressie heeft in epitheliale en hematologische maligniteiten, waarbij patiënten een slechte responsiviteit vertonen op de momenteel beschikbare therapieën2.
Structurele studies toonden aan dat AURKA twee stappen ondergaat om van een inactief naar een actief kinase te gaan. Ten eerste verandert de autofosforylering van Thr288 de conformatie van de kinetische pocket van het kinase en activeert deze3,4,5,6. Deze stap verhoogt de katalytische activiteit van AURKA in menselijke cellen en in Xenopus laevis3,6,7, waardoor het kinase wordt geprikkeld voor volledige activiteit. Eenmaal geactiveerd, induceert de interactie van AURKA met het doeleiwit voor Xklp2 (TPX2) een tweede conformationele verandering5. Deze verdere modificatie stelt AURKA in staat om volledige enzymatische activiteit te bereiken naar zijn substraten in de cel5,8,9,10.
Gedurende bijna twee decennia werden inzichten over de activering en activiteit van AURKA voornamelijk verkregen door een combinatie van biochemische benaderingen. Deze omvatten de detectie van gefosforyleerd Thr288 in cellen of in vivo als een kenmerk van AURKA-activering, kristallografische analyses en in vitro of in cellulokinasetests om de activiteit van AURKA1 te onderzoeken. De spatiotemporele oplossing van deze benaderingen is echter slecht of afwezig, en er waren nieuwe oplossingen nodig om de kennis van de dynamiek van deze twee gebeurtenissen te verbreden.
De ontwikkeling van fluorescerende sondes in de afgelopen jaren vergemakkelijkte de monitoring van AURKA in levende cellen, waardoor de activering ervan met een grotere spatiotemporale resolutie mogelijk werd. De meest specifieke sensoren voor AURKA die tot nu toe zijn ontwikkeld, vertrouwen op het FRET-principe (Förster’s Resonance Energy Transfer)11 om onderscheid te maken tussen inactieve en actieve AURKA. De eerste sensor die werd ontwikkeld was een substraatgebaseerde biosensor van AURKA-kinaseactiviteit. Substraatgebaseerde biosensoren worden gevormd door een korte aminozuursequentie gericht op een bepaald kinase voor fosforylering en ingebracht in een donor / acceptor FRET-paar en een bindend domein dat het gefosforyleerde residu herkent, wat de vouwing van de biosensor helpt voor een efficiënt FRET-proces12. In het geval van AURKA werd een 14-aminozuurfragment van KIF2C gericht op fosforylering ingebracht tussen een CFP-YFP donor/acceptorpaar13. Deze sensor heeft echter een aantal grote nadelen. Ten eerste kan de KIF2C-sequentie die in deze sonde wordt gebruikt, zowel door AURKA als door het nauw verwante kinase AURKB worden aangevallen, waardoor de specificiteit van deze biosensor wordt verminderd. Ten tweede vertrouwt de sensor op het endogene kinase voor fosforylering. Daarom kan de FRET-efficiëntie niet detecteerbaar of niet significant zijn als de hoeveelheden van het kinase beperkend zijn (bijvoorbeeld in subcellulaire compartimenten of celcyclusfasen). Om deze beperkingen te overwinnen, werd een nieuwe klasse AURKA-sensoren gecreëerd die bekend staat als “conformatiesensoren”. In deze sondes werd de volledige lengtesequentie van AURKA ingebracht in een donorfluoofoor aan het N-eindpunt en een acceptorfluoofoor aan het C-eindpunt. Inactief AURKA presenteert een “open” conformatie, die de N- en C-termini van het kinase van elkaar wegbrengt. Met een dergelijke afstand tussen de twee termini (> 10 nm), bevindt het donor/acceptorpaar zich in een niet-permissieve configuratie voor FRET. Integendeel, autofosforyleerd AURKA neemt een “gesloten” conformatie aan, met de twee eiwitatomen termini en de twee fluoroforen in de nabijheid. Hiermee werd aangetoond dat FRET tussen de donor en de acceptor mogelijk is, die kan worden gemeten met behulp van de variaties in de levensduur van de donor14,15. Dergelijke sondes bieden verschillende voordelen. Ten eerste zijn ze genetisch gecodeerd en kunnen ze worden gebruikt om het endogene kinase in de cel te vervangen. Ten tweede redden ze de fenotypen geïnduceerd door de knockdown van AURKA, wat aangeeft dat ze functioneel zijn in de cel. Ten derde maken ze het mogelijk om de activering van het kinase te volgen in verschillende subcellulaire compartimenten en gedurende de hele celcyclus. De sondes detecteerden de activering van AURKA op locaties waar bekend is dat het kinase wordt geactiveerd (d.w.z. centrosomen en de mitotische spindel), en namen ook deel aan het ontdekken van de activering van AURKA bij de mitochondriën16. Ten slotte maakten deze sensoren screenings met een hoog gehalte mogelijk op basis van FRET / FLIM, waarbij de conformatieveranderingen van AURKA werden gebruikt om nieuwe farmacologische remmers te identificeren17.
In dit werk beschrijven we een procedure om AURKA-activering in gekweekte cellen te visualiseren. Eerst zullen we inzicht geven in mogelijke fluorofoorparen voor FRET. De keuze van het meest geschikte donor/acceptorpaar wordt gemaakt op basis van de beschikbare microscoopopstelling, of een bepaalde downstream-toepassing als multiplex FRET18,19. Vervolgens stellen we een pijplijn voor om het gedrag van de biosensoren te onderzoeken die zijn gekozen in een snelle FRET / FLIM-microscoopopstelling. Deze pijplijn zal zich uitstrekken van celkweek- en synchronisatieprocedures tot FLIM-acquisitie en data-analyse. Ten slotte zullen we de potentiële voordelen van dit protocol bespreken, omdat een analoge strategie voor biosensorontwerp kan worden toegepast op andere kinasen, en het kan ook worden gebruikt met andere FRET-gebaseerde beeldvormingssystemen.
Genetisch gecodeerde FRET-biosensoren zijn betrouwbare hulpmiddelen om de activering van afzonderlijke eiwitten of van volledige signaalroutes te meten41. Met name de AURKA FRET biosensor vormt een voorkeursmanier om de activering van het kinase in tijd en ruimte te onderzoeken. Sommige elementen verdienen echter speciale aandacht bij het ontwerpen of optimaliseren van een FRET-biosensor, niet alleen in algemene termen, maar meer specifiek voor AURKA.
Ten eerste kunnen de aard en de relatieve positie van het donor/acceptor FRET-paar worden aangepast voor specifieke functies van dit kinase. AURKA is sterk verrijkt aan de mitotische spil tijdens mitose, maar het is aanwezig gedurende de hele celcyclus en op verschillende subcellulaire locaties (bijv. Centrosomen, de kern en mitochondriën)1,2. Als de biosensor moet worden gebruikt in specifieke compartimenten zoals mitochondriën, die een zure pH kunnen bereiken, moet de keuze worden gemaakt voor een pH-ongevoelig donor-acceptor FRET-paar als mTurquoise2 / shadowG. Bovendien zou het plaatsen van de FRET-donor op de C-terminus een betere visualisatie van de biosensor in dit subcellulaire compartiment mogelijk kunnen maken en mogelijk zelfs de FRET-detectie kunnen optimaliseren, aangezien werd aangetoond dat AURKA N-terminus gedeeltelijk afsplitste bij mitochondriën16,42.
Ten tweede zou een nog onontgonnen manier om de AURKA FRET-biosensor te optimaliseren een zorgvuldiger ontwerp van linkers vereisen tussen AURKA over de volledige lengte en het donor/ acceptor-paar. Niet alleen de afstand tussen het fluorescerende paar, maar ook de eigenschappen van de linker zelf bleken belangrijke factoren te zijn om de FRET-efficiëntie te verbeteren43,44,45,46. In dit licht kan het verhogen van de stijfheid of de flexibiliteit van de linker schadelijk zijn voor de FRET-efficiëntie of deze verder verbeteren.
Ten derde is bekend dat de overexpressie van AURKA mitotische spindelafwijkingen induceert in een aanzienlijk deel van de cellen2. Het zou interessant zijn om ΔLifetime te vergelijken die wordt verkregen door hetzelfde FRET-construct tot expressie te brengen onder een sterke promotor zoals cytomegalovirus (CMV) – een van de meest voorkomende promotors die worden aangetroffen in vectoren van zoogdierexpressie – of onder de AURKA minimal promoter sequence (CTTCCGG)14,47. Eerder werd aangetoond dat deze promotor monopolaire of multipolaire spindels redde die ontstonden na het neerhalen van het kinase, en het gebruik ervan veroorzaakte niet per se verstoringen van de celcyclus14,47. Hoewel FLIM ongevoelig is voor eiwitexpressieniveaus en relatieve concentraties in de cel11, zou het profiteren van een grondige vergelijking van de twee promotors op dezelfde biosensoropstelling het begrip van de pool van geactiveerde AURKA op een bepaalde locatie verbreden. Bovendien zou het nieuwe inzichten bieden over hoe AURKA-activering kan veranderen bij overexpressie, wat relevant is voor epitheliale en hematologische kankerparadigma’s.
Ten slotte moet ook rekening worden gehouden met de downstream FRET-toepassing. Een toekomstperspectief op het gebied van AURKA zou zijn om de kinase conformational biosensor te cumuleren met een substraat-gebaseerde biosensor. Het analyseren van het FRET-gedrag van twee biosensoren tegelijkertijd – een proces dat bekend staat als multiplex FRET – vereist een donkere acceptor op de eerste biosensor om spectrale bloeding in het tweede donorkanaal te voorkomen. In de context van AURKA zou dit het opwindende nieuwe perspectief openen van het detecteren van de activering van het kinase met de eerste biosensor en de enzymatische activiteit ervan naar een bepaald substraat met het tweede. Recente ontwikkelingen in multiplexing maken het nu mogelijk om tot drie biosensoren tegelijk te cumuleren48. Het toepassen van een vergelijkbare methode in de context van AURKA zou een veelbelovende strategie kunnen zijn, niet alleen om het activeringsactiviteitsspel van het kinase te testen, maar ook om AURKA-signaleringscascades met een ongekende spatiotemporale resolutie te verkennen.
Kortom, FRET/FLIM is een handige manier om de kennis over eiwitactiviteit te verdiepen. Aan de ene kant maakt het het mogelijk om de lokalisatie van een bepaald eiwit in levende cellen te visualiseren, dankzij ten minste één fluorescerend deel. Aan de andere kant kan het eiwitconformatieveranderingen ontrafelen, wat informatief kan zijn over eiwitactivering en / of -activiteit. Daarom hebben FRET/FLIM en conformationale FRET-biosensoren het potentieel om wijdverspreide methoden te worden om signaalroutes in levende cellen te volgen, en met een voortreffelijke spatiotemporale resolutie.
The authors have nothing to disclose.
We danken de ingenieurs van het Microscopy-Rennes Imaging Center (MRic, BIOSIT, Rennes, Frankrijk) voor advies en hulp, en in het bijzonder X. Pinson voor het kritisch lezen van het manuscript. MRic is lid van de nationale infrastructuur France-BioImaging ondersteund door het Franse Nationale Onderzoeksbureau (ANR-10-INBS-04). Dit werk werd ondersteund door het Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), de Ligue Contre le Cancer Comités d’Ille et Vilaine, des Côtes d’Armor et du Finistère en de Association pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) aan G.B.
Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
LabTek | Nunc | 2515380 | |
Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |