Создание транспосонных библиотек в грам-отрицательных бактериях для секвенирования высокой пропускной способности

Summary

Мы описываем метод генерации насыщенных библиотек транспосонных мутантов в грам-отрицательных бактериях и последующую подготовку библиотек ДНК-ампликона для секвенирования высокой пропускной способности. В качестве примера мы ориентируемся на патоген ESKAPE, Acinetobacter baumannii, но этот протокол подотменен широкому кругу грам-отрицательных организмов.

Abstract

Транспосон секвенирования (Tn-seq) является мощным методом, который сочетает в себе транспосон мутагенез и массивные параллельные секвенирования для выявления генов и путей, которые способствуют бактериальной пригодности в широком диапазоне условий окружающей среды. Приложения Tn-seq обширны и позволяют не только изутовить генотипно-фенотипные отношения на уровне организма, но и на уровне населения, сообщества и систем. Грам-отрицательные бактерии тесно связаны с фенотипами устойчивости к противомикробным препаратам, что привело к увеличению числа случаев отказа от лечения антибиотиками. Устойчивость к противомикробным препаратам определяется как бактериальный рост в присутствии в противном случае смертельных антибиотиков. Антимикробный колистин «последней линии» используется для лечения грамотрицательных бактериальных инфекций. Тем не менее, несколько грамотрицательных патогенов, в том числе Acinetobacter baumannii может развиться устойчивость к колистину через ряд молекулярных механизмов, некоторые из которых были охарактеризованы с помощью Tn-seq. Кроме того, пути трансдукции сигнала, которые регулируют устойчивость к колистину, различаются в пределах грам-отрицательных бактерий. Здесь мы предлагаем эффективный метод транспосонного мутагенеза в A. baumannii, который упрощает генерацию насыщающих транспосонной библиотеки вставки и строительства библиотеки ампликона, устраняя необходимость ограничения ферментов, перевязки адаптера и очистки геля. Методы, описанные в этом позволит углубленный анализ молекулярных детерминантов, которые способствуют A. baumannii фитнес, когда оспаривается с колистином. Протокол также применим к другим грамотрицательных патогенам ESKAPE, которые в первую очередь связаны с лекарственно устойчивыми больничнымиинфекциями.

Introduction

Открытие антибиотиков, несомненно, является одним из наиболее эффективных событий,^th связанных со здоровьем 20-го века. Антибиотики не только быстро разрешают серьезные бактериальные инфекции, но и играют ключевую роль в современной медицине. Основные операции, трансплантации и достижения в области неонатальной медицины и химиотерапии оставляют пациентов восприимчивыми к опасным для жизни инфекциям, и эти^{методы лечения не были бы возможны без антибиотиков 1,,2}. Однако быстрое развитие и распространение устойчивости к антибиотикам среди патогенных микроорганизмов человека значительно снизило эффективность всех клинически важных классов антибиотиков^3. Многие бактериальные инфекции, которые когда-то были легко очищены с помощью антибиотиков лечения, больше не реагировать на классические протоколы лечения, вызывая серьезную угрозу для глобального^{общественного здравоохранения 1}. Устойчивость к противомикробным препаратам (AMR) является, где бактериальные клетки растут в противном случае смертельные концентрации антибиотиков, независимо от^{продолжительности лечения 4,5}. Существует настоятельная необходимость понимания молекулярных и биохимических факторов, регулирующих АМР, которые помогут направлять развитие альтернативных противомикробных препаратов. В частности, патогены ESKAPE являются проблематичными в клинических условиях и связаны с обширным AMR. К ним относятся Enterococcus faecium, S taphylococcusaureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, P seudomonasaeruginosa и E nterobacter spp. В то время как несколько механизмов способствуют АМР в патогенах ESKAPE, последние четыре организма являются грам-отрицательными.

Грамотрицающие бактерии собирают определяющую внешнюю мембрану, которая защищает их от неблагоприятных условий окружающей среды. Внешняя мембрана служит проницаемым барьером для ограничения проникновения токсичных молекул, таких как антибиотики, в клетку. В отличие от других биологических мембран, внешняя мембрана асимметрична. Внешняя листовка обогащена поверхностно открытым липополисахаридом, в то время как внутренняя листовка представляет собой смесь фосфолипидов^6. Молекулы липополисахарида закреплены на внешней мембране сохраненным липидом A moiety, встроенным в липидный билейлер⁷. Канонический липид домен Escherichia coli lipopolysaccharide необходим для роста большинства грамотрицательных бактерий и синтезируется девятишаговым энзиматическим^путем,который является одним из самых фундаментальных и сохранившихся путей в Грам-отрицательных^{организмах 6,,7},⁸.

Полимиксины являются катионическими антимикробными пептидами, которые нацелены на липидный домен липополисахарид, чтобы возмущать внешнюю мембрану и окисить клетку. Электростатическое взаимодействие между положительно заряженными остатками полимиксином и отрицательно заряженными липидными фосфатными группами нарушает бактериальную клеточную мембрану, что в^{конечном итоге приводит к гибели клеток 9,,10,,11,,12,,13.} Колистин (полимиксин E) является последним курортом противомикробных препаратов, используемых для лечения инфекций, вызванных множественной лекарственной устойчивостью Грам-отрицательных нозокомиальных патогенов, таких как Acinetobacter baumannii^14,15,16. Впервые обнаружены в 1947 году, полимиксины производятся почвенными бактериями, Paenibacillus polymyxa^17,18,19. Полимиксины были предписаны для лечения грамотрицательных инфекций в течение многих лет, прежде чем их клиническое использование было ограничено из-за сообщений о значительной нефро-^{и нейротоксичности 20,21}.

A. baumannii является нозокомиальным грам-отрицательным патогеном, который резко увеличил заболеваемость и смертность исходов пациентов за последние^{десятилетия 22}. То, что когда-то рассматривалось как патоген с низкой угрозой, в настоящее время представляет значительный риск для больничной инфекции во всем мире из-за его невероятной способности приобретать АМР и^{высокого риска эпидемии 23,,24}. На долю A. baumannii приходится более 10% нозокомиальных инфекций в Соединенных Штатах. Болезнь проявляется как пневмония, бактериемия, инфекции мочевыводящих путей, инфекции кожи и мягких тканей, менингит и эндокардит²⁵. Варианты лечения инфекций A. baumannii сократились из-за устойчивости почти ко всем классам антибиотиков, включая β-лактамы, фторхинолоны, тетрациклин и аминогликозиды^23,24. Распространенность множественной лекарственной устойчивостью, широко лекарственно-устойчивой и пан-лекарственной устойчивостью A. baumannii изолирует привело к возрождению лечения колистином, который считается одним из немногих оставшихся терапевтических вариантов по-прежнему эффективны против множественной лекарственной устойчивостью A. baumannii. Однако повышенная устойчивость к колистину среди изолятов A. baumannii еще больше усилила^{свою угрозу глобальному общественному здравоохранению 10,,11,,12,,13,,27,,30,,31.}

Недавние достижения в технологиях секвенирования с высокой пропускной способностью, таких как транспосонное секвенирование (Tn-seq), предоставили важные инструменты для продвижения нашего понимания бактериальной пригодности in vitro и in vivo. Tn-seq является мощным инструментом, который может быть использован для изучения генотипно-фенотипных взаимодействий у бактерий. Tn-seq широко применим к бактериальным патогенам, где он сочетает в себе традиционный транспозонный мутагенез с массивным параллельным секвенированием для быстрого вставки карты сайтов, которые могут быть использованы для связи мутаций ДНК с фенотипическими вариантами^{в масштабах генома 32,33,34,35}. Хотя методы транспозона мутагенез были ранее описаны, общие шаги аналогичны³³. Во-первых, библиотека вставки генерируется с использованием транспосонного мутагенеза, где каждая бактериальная клетка в популяции ограничивается одной транспосонной вставкой в геномную ДНК (гДНК). После мутагенеза объединяются отдельные мутанты. gDNA извлекается из пула мутантов вставки, а транспосонные соединения усиливаются и подвергаются секвенированию высокой пропускной способности. Считывает представляют места вставки, которые можно отобразить к геному. Транспосон вставки, которые уменьшают фитнес быстро выпадают из населения, в то время как полезные вставки обогащаются. Tn-seq сыграл важную роль для продвижения нашего понимания того, как гены влияют на бактериальную пригодность в^{стрессе 33}.

Система транспосона моряка Himar1, закодированная в pJNW684, была специально построена и оптимизирована для транспозонного мутагенеза. Она включает в себя маринер-семейныйтранспосон, обрамляющий ген резистентности к канамицину, который используется для выбора транспосонных мутантов в A. baumannii. Он также кодирует A. baumannii конкретных промоутер, что диски выражение транспозазы кодирования гена³⁶. Морскойтранспосон также содержит два трансляционных терминатора вниз по течению гена резистентности канамицина, который предотвращает чтение вниз по течению вставки³⁷. pJNW684 также несет RP4/oriT/oriR6K-условное происхождение репликации, которая требует гена спир, внесенного донорским штаммом, чтобы^{воспроизвести 38}. В отсутствие гена «Спир» вектор pJNW684, несущий транспозиционное оборудование, не сможет воспроизвести в штамме получателя A. baumannii ^10,,36,,38. Поэтому во время бактериального спряжения в геном реципиента вставляется только транспозон без фоновой вставки плазмиды, которая несет в себе ген транспозазы. Это важно, потому что потеря активности транспозазы вместе с плазмидой приводит к одному, стабильному событию транспозиции, которое предотвращает перемещение транспозона в разные места, как только он вставляется в геном получателя.

pJNW648 также был протестирован на активность в другом грам-негативном организме, кишечной палочке. Успешная сборка насыщенной библиотеки Tn-seq в штамме кишечной палочки W3110 показала, что система может выполнять мутагенез в широком диапазоне патогенов, включая энтеробактерии. Кроме того, A. baumannii конкретных промоутер, что диски транспозазы выражение можно быстро обмениваться с видом конкретных промоутер. Наконец, ген резистентности к канамицину можно обменять на другие кассеты сопротивления, в зависимости от фенотипа AMR изучаемого организма.

Одним из факторов, способствующих устойчивости колистина в A. baumannii является введения недостаточных доз, где бактерии подвергаются селективного давления на нелетальных^{уровнях 39}. Несколько докладов показали, что субибибиторные концентрации противомикробных препаратов может вызвать регулируемые реакции, которые изменяют физиологию^{клеток, чтобы уменьшить восприимчивость всей бактериальной популяции 11,,12,,30,,31}. Используя Tn-seq, мы обнаружили факторы, которые регулируют устойчивость колистина в штамме A. baumannii ATCC 17978 после^{воздействия ингибирующей 10} и субибибиторных концентраций колистина. В этом примере подробно Tn-seq метод, который упрощает строительство и обогащение насыщенной библиотеки транспозонных мутантов с использованием морякаоснове семьи^{транспозонов 40,41}. В то время как несколько протоколов Tn-seq генерируют 20,000 – 100,000^{мутантов 35,42,43,44,45,46}, протокол, описанный в настоящем может быстро генерировать транспосон библиотеки 400000 й мутантов, что примерно приравнивается к транспосонной вставке каждые 10-базовые пары в A. baumannii¹⁰. Кроме того, размер библиотеки может быть увеличен без значительных дополнительных усилий. Этот метод также устраняет необходимость ограничения эндонуклейсов, перевязки адаптера и очистки геля, что может уменьшить окончательное разнообразие библиотек.

Protocol

1. Препарат бактериального штамма Полоса “донорский” штамм (E. coli MFD DAP-/pJNW684, Таблицаматериалов ) для изолированных колоний на Лурия-Бертани агар дополнен 600 ЗМ диаминопимеловой кислоты (DAP), 100 мг/л ампициллина и 25 мг/л канамицина. Инкубировать на ночь при 37 градусов ?…

Representative Results

Изложенные методы описывают генерацию высокой плотности транспосон библиотеки в штамме A. baumannii ATCC 17978 через бактериальное спряжение с использованием E. coli MFD DAP-, который повторяет плазмидный pJNW684 (Рисунок 4B). В подробном протоколе используется двухроциаль…

Discussion

A. baumannii является новой угрозой для глобального общественного здравоохранения в связи с быстрым приобретением AMR против “последней линии” терапии, такие как^{колистин 10,,11,,12,,23,,24,30<…}

Materials

10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351029
150mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351058
1X B&W	N/A	N/A	Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid	Alfa Aesar	B2239103	used at 600 µM
2X B&W	N/A	N/A	Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials	Corning	09-761-71
Glass beads	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-602	Scraping tool
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	used at 25 mg/L
LB agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer	N/A	N/A	9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875