Ce protocole décrit comment générer des blessures excisionnelles bilatérales et pleine épaisseur chez la souris et comment surveiller, récolter et préparer les plaies pour l’analyse morphométrique. On y trouve une description détaillée de la façon d’utiliser les sections histologiques périodiques pour définir, quantifier et détecter avec précision les défauts morphométriques.
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Article de méthode
Modèle de cicatrisation des plaies excisional murine et analyse histologique des plaies morphométriques
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le modèle de blessure excisional murine a été employé intensivement pour étudier chacune des phases séquentiellement superposées de la guérison de blessure : inflammation, prolifération et remodelage. Les plaies murines ont un lit de plaie histologiquement bien défini et facilement reconnaissable sur lequel ces différentes phases du processus de guérison sont mesurables. Sur le terrain, il est courant d’utiliser un « milieu » arbitrairement défini de la plaie pour des analyses histologiques. Cependant, les blessures sont une entité tridimensionnelle et souvent pas histologically symétrique, soutenant la nécessité d’une méthode bien définie et robuste de quantification pour détecter des défauts morphométriques avec une petite taille d’effet. Dans ce protocole, nous décrivons la procédure pour créer des plaies excisionnelles bilatérales de pleine épaisseur chez la souris ainsi qu’une instruction détaillée sur la façon de mesurer les paramètres morphométriques à l’aide d’un programme de traitement d’image sur certaines sections de série. Les mesures en deux dimensions de la longueur de la plaie, de la longueur épidermique, de la zone épidermique et de la zone de la plaie sont utilisées en combinaison avec la distance connue entre les sections pour extrapoler la zone épidermique à trois dimensions couvrant la plaie, la zone globale de la plaie, le volume épidermique et le volume des plaies. Bien que cette analyse histologique détaillée soit plus longue et plus gourmande en ressources que les analyses conventionnelles, sa rigueur augmente la probabilité de détecter de nouveaux phénotypes dans un processus intrinsèquement complexe de cicatrisation des plaies.
Introduction
La cicatrisation cutanée des plaies est un processus biologique complexe dont les phases se chevauchent séquentiellement. Il nécessite la coordination des processus cellulaires et moléculaires qui sont régulés temporellement et spatialement afin de restaurer la fonction barrière de l’épithélium endommagé. Dans la première phase, l’inflammation, les neutrophiles et les macrophages migrent dans la plaie, mobilisant les défenses locales etsystémiques 1. Suivre et chevaucher la phase inflammatoire est le stade de prolifération. Les fibroblastes commencent à proliférer rapidement et à migrer dans le tissu de granulation. Les kératinocytes éloignés d....
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Protocole
Toutes les expériences ont été réalisées conformément à la réglementation fédérale et la politique et les procédures de l’Université de l’Iowa ont été approuvées par l’IACUC de l’Université de l’Iowa.
1. Animaux et élevage
- Utilisez des souris adultes de la lignée de souris désirée à l’âge de 8-10 semaines lorsque le stade du follicule pileux est en télogène.
- Le jour de la chirurgie, séparez les souris dans des cages propres et individuellement maison pour minimiser la perturbation des plaies.
2. Chirurgie
REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de maintenir des condi....
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Résultats
La figure 5 représente la fourchette des valeurs mesurées et calculées obtenues en effectuant une analyse morphométrique sur des plaies de type sauvage générées par plusieurs chirurgiens et analysées par différents individus dans différentes souches de souris. Les souris de type sauvage de différentes souches peuvent afficher des différences statistiques telles que décrites dans nos études et dans lalittérature 9,10. Sur la base de c.......
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Discussion
Le modèle bilatéral de blessure excisional est une procédure hautement personnalisable qui peut être employée pour étudier beaucoup de différents aspects de la guérison de blessure. Avant de commencer un projet de cicatrisation des plaies, les chercheurs devraient effectuer une analyse de puissance pour déterminer le nombre de blessures nécessaires pour détecter un défaut d’une taille d’effet particulière. Des incohérences existent dans la littérature sur la question de savoir si des souris ou des blessures individuelles.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants à tous les membres du Laboratoire Dunnwald qui ont contribué à l’optimisation de ce protocole au fil des ans, et à Gina Schatteman dont la persistance dans la promotion de l’utilisation de la section sérielle pour l’analyse des plaies a rendu possible sa création. Ces travaux ont été soutenus par le financement des NIH/NIAMS à Martine Dunnwald (AR067739).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 100 % éthanol | |||
| 70 % éthanol | |||
| 80 % éthanol | |||
| 95 % éthanol | |||
| Préparation à l’alcool | NOVAPLUS | V9100 | 70 % alcool isopropylique, hydroxyde |
| d’ammonium | |||
| biopsie | Cellpath | 22-222-012 | |
| Feuille | Quelque chose de ferme mais manipulable de la taille d’une feuille de papier | ||
| Microscope | Avec des capacités d’acquisition numérique et un objectif 4X | ||
| Applicateurs | |||
| Lambeaux de | 22 x 60 #1 | ||
| Feuilles | |||
| de cire dentaireAppareil photo | Inclure une règle pour l’échelle, le cas échéant | ||
| Dissection aiguille de taquinage (droite) | |||
| Moules d’enrobage | 22 x 22 x 12 | ||
| Anneaux d’enrobage | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Acide | |||
| Tondeuse à | |||
| Coussin chauffant | Conair | Coussin chauffant sec et humide | |
| Hématoxyline | |||
| Microtome | |||
| Pinceaux Paraffine | |||
| Type 6 | |||
| Paraformaldéhyde | |||
| Permount | |||
| Solution tampon de phosphate (PBS) | |||
| Povidone-iode | Aplicare | 82-255 | |
| Cassette de traitement | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Lames de rasoir | ASR.009 | Lames de scalpel à usage régulier | |
| #10 | |||
| Manche | |||
| Ciseaux chirurgicaux tranchants stériles | pour la chirurgie | ||
| Poinçons | Taille déterminée par le chercheur | ||
| Boîtes de | |||
| Chauffe-lames | |||
| Lames de microscope supergivrées | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Bain-marie | |||
| Station d’enrobage | de tissus Minimum d’un distributeur de paraffine et d’une plaque froide | ||
| Processeur | de tissus Minimum d’un four avec pompe à vide | ||
| Triple antibiotique Pince à épiler pour pommade | |||
| , pointe | stérile pour | ||
| pince à épiler chirurgicale, pointe | stérile pour la chirurgie | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
Références
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular....
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Réimpressions et autorisations
