Estrategia de cultivo In Vitro para ovocitos del folículo antral temprano en el ganado bovino
Summary
Describimos los procedimientos para el aislamiento de ovocitos en crecimiento de los folículos ováricos en las primeras etapas de desarrollo, así como la instalación de un sistema de cultivo in vitro que puede apoyar el crecimiento y la diferenciación hasta la etapa completamente adulta.
Abstract
La reserva limitada de ovocitos maduros y fertilizables representa una barrera importante para el éxito de la reproducción asistida en mamíferos. Teniendo en cuenta que durante la vida reproductiva sólo alrededor del 1% de los ovocitos en un ovario maduro y ovulado, se han desarrollado varias técnicas para aumentar la explotación de la reserva ovárica a la creciente población de folículos no ovulatorios. Estas tecnologías han permitido intervenciones de preservación de la fertilidad, programas de selección en ganado y conservación de especies en peligro de extinción. Sin embargo, el enorme potencial de la reserva ovárica sigue siendo en gran medida sin explotar. En las vacas, por ejemplo, se han hecho algunos intentos de apoyar la cultura in vitro de ovocitos en etapas específicas del desarrollo, pero aún no se han desarrollado protocolos eficientes y fiables. Aquí describimos un sistema de cultivo que reproduce las condiciones fisiológicas de la etapa folicular correspondiente, definida para desarrollar ovocitos de crecimiento in vitro recogidos de los folículos antrales tempranos bovinos a la etapa completamente adulta, correspondiente al folículo antral medio in vivo. Se utilizó una combinación de hormonas y un inhibidor de la fosfodiesterasa 3 para prevenir la reanudación meótica prematuramente y para guiar la diferenciación de los ovocitos.
Introduction
Durante la vida reproductiva, sólo una fracción mínima de los ovocitos que están presentes en un ovario maduro, se liberan en las trompas de Falopio tras la ovulación, y están disponibles para ser fertilizados y se convierten en un embrión viable1. Por otro lado, la mayoría de los ovocitos dentro de un ovario se someten a atresia y nunca se ovulan. Las tecnologías de producción in vitro de embriones (IVP) han intentado aumentar la explotación de la reserva ovárica2,3. Hasta ahora, estas tecnologías han permitido intervenciones de preservación de la fertilidad, programas de selección en el ganado y conservación de especies en peligro de extinción. Sin embargo, la mayoría de los protocolos utilizan ovocitos que básicamente han completado la fase de crecimiento dentro del folículo ovárico antral, y por lo tanto se conocen como ovocitos completamente crecidos. En el ganado bovino, donde las tecnologías IVP son ampliamente utilizadas, los ovocitos completamente crecidos alcanzan un diámetro final de aproximadamente 120 m y se recogen de folículos que abarcan de 2 a 8 mm de diámetro (folículos antrales medios)1. Tras el aislamiento de los folículos, estos ovocitos son in vitro madurados y fertilizados. Los cigotos se cultivan hasta la etapa del blastocisto y se transfieren a un receptor o crioconservados. En el ganado bovino, así como en muchas otras especies, a pesar del potencial que ofrecen IVP, el número de embriones producidos in vitro por vaca no mejoró en gran medida durante los últimos 40 años. Esto se debe en parte al número limitado de ovocitos completamente crecidos que pueblan un ovario en un momento dado que se puede recuperar y someter a las técnicas estándar de IVP4,5,6.
Los ovocitos encerrados dentro de los folículos antrales tempranos, es decir, aquellos folículos de menos de 2 mm de diámetro, representan una fuente potencial que se utilizará en los programas de conservación de la fertilidad7, ya que un ovario contiene aproximadamente 10 veces más folículos antrales tempranos que los folículos antrales medios8. Sin embargo, estos ovocitos todavía están en fase de crecimiento y aún no han alcanzado la etapa9completamente cultivada. Como tal, todavía están transcripcionalmente activos, produciendo mRNAs que se almacenarán para pasos posteriores del desarrollo, y todavía no han sido sometidos a todo el proceso de diferenciación necesario para conferir a los ovocitos con la capacidad de reanudar y completar espontáneamente la meiosis que una vez aislado del compartimento folicular10,,11. Por lo tanto, no pueden someterse directamente a los protocolos estándar de maduración in vitro (IVM), pero requieren un período adicional de cultivo que les permita completar la fase de crecimiento y diferenciarse adecuadamente.
La transición de la etapa de crecimiento a la etapa completamente cultivada, que en el ganado se produce cuando el folículo se desarrolla desde la etapa antral temprana a la etapa antral media, es uno de los pasos críticos durante el desarrollo de ovocitos. En bovinos, varios estudios intentaron recapitular estos eventos in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Sin embargo, hasta la fecha no se han desarrollado protocolos fiables y sólo se ha informado de un éxito limitado. Según estudios anteriores20, estos ovocitos en crecimiento constituyen una población homogénea. Además de ser transcripcionalmente activa, su cromatina se dispersa en la vesícula germinal (GV), en una configuración que se llama GV02,21. Por el contrario, la población de ovocitos totalmente crecidos obtenida a partir de folículos antrales medios es más heterogénea, una condición que se refleja en los diversos grados de compactación de la cromatina (GV1, GV2 y GV3) que se pueden observar20. Entre ellos, datos anteriores han demostrado que los ovocitos GV2 y GV3 se caracterizan en general por una mejor calidad y una mayor competencia embrionaria de desarrollo20,,21,,22,,23,,24.
Partiendo de las observaciones anteriores, aquí describimos un sistema de cultivo de 5 días de largo de ovocitos (L-IVCO) que permite la diferenciación de los ovocitos aislados como complejos cúmulos-ovocitos (COC) de los folículos antrales tempranos. Esta estrategia de cultivo ha evolucionado a partir de 10 años de estudios realizados en nuestro laboratorio y sus raíces su terreno sobre el cultivo de ovocitos in vitro (IVCO)2,sistemas de23,,25 y la suplementación de zinc durante el cultivo de ovocitos. Se utilizó una combinación de hormona estimulante del folículo (FSH) y un inhibidor de la fosfodiesterasa-3 (PDE3), capaz de mejorar la comunicación cúmulo- ovocitos2,prevenir la reanudación meótica prematura2y apoyar el crecimiento de ovocitos2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un sistema de cultivo para el cultivo de ovocitos que promueve el desarrollo de ovocitos durante 5 días apoyando su viabilidad y previniendo la reanudación meótica. Este último aspecto es de suma importancia para permitir el crecimiento y la diferenciación continuos necesarios para conferir el ócito con competencia de desarrollo meótica y embrionaria2,20, que de otro modo quedaría bloqueada por una reanudación prematura de la división …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 y UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Hepes | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | ||
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for hepes-buffered TCM199 |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for M199-D |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
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