Vi beskriver de förfaranden för isolering av växande oocytes från äggstockscancer folliklar i tidiga skeden av utvecklingen, samt inställning av en in vitro-kultur system som kan stödja tillväxt och differentiering upp till fullvuxen skede.
Den begränsade reserven av mogna, fruktbara äggceller utgör en stor barriär för framgång assisterad reproduktion hos däggdjur. Med tanke på att under den reproduktiva livslängden endast cirka 1% av äggceller i en äggstock mogna och ägglossning, har flera tekniker utvecklats för att öka exploatering av äggstocksreserven till den växande befolkningen av icke-ägglossning folliklar. Sådan teknik har tillåtit insatser av fertilitet bevarande, urvalsprogram i boskap, och bevarande av utrotningshotade arter. Men den stora potentialen i äggstocksreserven är fortfarande i stort sett outnyttjad. Hos kor har till exempel vissa försök gjorts att stödja in vitro-kulturen av oocyter i specifika utvecklingsstadier, men effektiva och tillförlitliga protokoll har ännu inte utvecklats. Här beskriver vi ett kultursystem som återger de fysiologiska villkoren för motsvarande follikulära skede, definieras för att utveckla in vitro växande oocyter som samlats in från nötkreatur tidiga antrala folliklar till fullvuxen skede, motsvarande den medelstora antral follicle in vivo. En kombination av hormoner och en phosphodiesterase 3-hämmare användes för att förhindra untimely meiotic återupptagande och att vägleda äggcells differentiering.
Under den reproduktiva livslängden, endast en minimal fraktion av de äggceller som är närvarande i en äggstock mogna, frigörs i äggledarna vid ägglossningen, och är tillgängliga för att befruktas och utvecklas till en livskraftig embryo1. Å andra sidan, de flesta av äggceller inom en äggstock genomgår atresia och är aldrig ägglossning. In vitro embryo produktion (IVP) teknik har försökt att öka utnyttjandet av äggstocksreserven2,3. Hittills har sådan teknik tillåtit insatser av fertilitet bevarande, urvalsprogram i boskap, och bevarande av utrotningshotade arter. Ändå, de flesta protokoll använder oocyter som i princip har avslutat tillväxtfasen inom antral ovariefolicle, och därmed kallas fullvuxna äggceller. Hos nötkreatur, där IVP-teknik används i stor utsträckning, når fullvuxna äggceller en slutlig diameter på cirka 120 μm och samlas in från folliklar som sträcker sig från 2 till 8 mm i diameter (medelstora antrala folliklar)1. Vid isolering från folliklaren, är sådana äggceller in vitro mognat och befruktas. Zygoterna odlas sedan upp till blastocyststadiet och antingen överförs till en mottagare eller cryopreserved. Hos nötkreatur, liksom i många andra arter, trots den potential som ivp erbjuder, förbättrades inte i hög grad antalet in vitro-producerade embryon per ko under de senaste 40 åren. Detta beror delvis på det begränsade antalet fullvuxna äggceller som fyller en äggstock vid en viss tidpunkt som kan hämtas och utsättas för standard IVP-tekniker4,5,6.
De oocyter inneslutna inom tidiga antral folliklar, dvs de folliklar som är mindre än 2 mm i diameter, utgör en potentiell källa som ska användas i fertilitet bevarande program7 , som en äggstock ungefär innehåller 10 gånger mer tidiga antral folliklar än medium en8. Dessa oocyter befinner sig dock fortfarande i tillväxtfasen och har ännu inte nått det fullvuxna stadiet9. Som sådan, de är fortfarande transkriptionellt aktiva, producerar mRNAs som kommer att lagras för senare utvecklingsmässiga steg, och har ännu inte genomgått alla de differentieringsprocess som krävs för att förläna oocyterna med förmåga att spontant återuppta och slutföra meios jag en gång isolerade från follikulära fack10,11. Därför kan de inte direkt överlämnas till standardprotokoll för in vitro-mognad (IVM), men de kräver ytterligare en period av kultur som skulle göra det möjligt för dem att slutföra tillväxtfasen och korrekt differentiera.
Övergången från det växande till det fullvuxna stadiet, som hos nötkreatur sker när follikeln utvecklas från den tidiga antral till det medelstora antralstadiet, är ett av de kritiska stegen under oocyteutvecklingen. Hos nötkreatur, flera studier försökt att rekapitulera dessa händelser in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Hittills har dock inga tillförlitliga protokoll utvecklats och endast begränsad framgång har rapporterats. Enligt tidigare studier20, dessa växande oocyter utgör en homogen population. Förutom att vara transkriptionellt aktiv, är deras kromatin spridda i germinal vesikel (GV), i en konfiguration som heter GV02,21. Omvänt är befolkningen i fullvuxna oocyter som erhålls från medelstora antrala folliklar mer heterogena, ett tillstånd som speglas av de olika grader av kromatin kompaktering (GV1, GV2 och GV3) som kan observeras20. Bland dessa har tidigare uppgifter visat att GV2 och GV3 oocyter är övergripande kännetecknas av en bättre kvalitet och högre embryonal utvecklingskompetens20,21,22,23,24.
Med utgångspunkt från ovanstående iakttagelser, här beskriver vi en 5-dagars lång kultur system av äggceller (L-IVCO) som gör det möjligt att differentiera oocytes isoleras som cumulus-oocyte komplex (COCs) från tidiga antrala folliklar. Denna kultur strategi har utvecklats från 10 år långa studier som genomförts i vårt labb och rötter sin grund på de tidigare utvecklade 24-48 timmar in vitro-oocyte kultur (IVCO)2, prematuration system23,25 och zink tillskott under äggcell kultur . En kombination av follikelstimulerande hormon (FSH) och en phosphodiesterase-3 (PDE3) hämmare, kunna förstärka cumulus-oocyte kommunikation2, förhindra untimely meiotisk återupptagande2, och stöd oocyte tillväxt2 användes.
Här beskriver vi ett kultursystem för växande oocyter som främjar oocyte utveckling i 5 dagar genom att stödja deras livskraft och förhindra meiotiska återupptagande. Denna senare aspekt är av yttersta vikt att tillåta fortsatt tillväxt och differentiering som är nödvändig för att förläna oocyten med meiotisk och embryonal utvecklingskompetens2,20, som annars skulle blockeras av ett förtidigt återupptagande av meiotiska divisionen.
<p class=…The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 och UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
Cell culture water | Sigma | W3500 | |
Cilostamide | Sigma | C7971 | |
Cysteamine | Sigma | M9768 | |
Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
Estradiol | Sigma | E2758 | |
Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
Gonal F | Merck Serono | ||
Heparin | Sigma | H3149 | |
Hepes | Sigma | H3784 | |
Vacuum pump | Cook-IVF | ||
Incubator | Sanyo | ||
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for hepes-buffered TCM199 |
Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for M199-D |
Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
Penicilin | Sigma | P3032 | |
Phenol Red | Sigma | P5530 | |
Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium choride | Sigma | P5886 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
Streptomycin | Sigma | S9137 | |
Testosterone | Sigma | 86500 | |
Triton X | Sigma | T9284 | |
Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
Water | Sigma | W3500 | |
Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |