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Neurosciences

인간 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 미세 혈관 내피 세포의 파생, 확장, 냉동 보존 및 특성화

Published: November 19, 2020
doi:
10.3791/61629
, ,
1Center for Genomic Medicine,Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry,Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program,Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry,Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program,McLean Hospital

Summary

이 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포를 분화하여 얻은 뇌 미생물 내피 세포를 도출, 확장 및 냉동 보존하고, 전 생체 모델에서 혈액 뇌 장벽 특성을 연구하는 적응된 방법을 자세히 설명합니다.

Abstract

뇌 미세 혈관 내피 세포 (BMEC)는 혈액 뇌 장벽 (BBB) 기능을 연구하기위한 전 생체 세포 모델을 개발하기 위해 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)와 분화 될 수있다. 이 수정된 프로토콜은 이전 프로토콜에 보고된 프로토콜과 는 다른 기증자 및 시약을 사용하여 인간 iPSC로부터 BME를 파생, 확장 및 냉동 보존하는 세부 단계를 제공합니다. iPSC는 4일 동안 필수 6배지로 처리되며, 그 다음으로 기본적인 섬유아세포 성장인자, 망막산 및 B27 보충제로 보충된 인체 내피 성 혈청 없는 배양 배지의 2일 이후에 이어지며. 6일째에, 세포는 2일 동안 콜라겐/섬유넥틴 매트릭스에 하위 배양된다. 면역 세포화학은 CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 및 SLC2A1을 사용하여 BMEC 마커 분석을 위해 8일째에 수행됩니다. 서양 블로팅은 BMEC 마커 발현, 및 SOX17의 부재, 내피 마커를 확인하기 위해 수행된다. 혈관 신생 잠재력은 발아 분석으로 입증됩니다. 트랜스 내피 전기 저항(TEER)은 7일부터 젓가락 전극 및 화산계를 사용하여 측정됩니다. ATP 결합 카세트 서브패밀리 B 멤버 1 및 ATP 바인딩 카세트 서브패밀리 C 멤버 1에 대한 Efflux 수송 활성은 8일째에 멀티 플레이트 판독기를 사용하여 측정된다. BMEC의 성공적인 파생은 관련 세포 마커의 존재에 의해 확인된다, SOX17의 낮은 수준, 혈관 신생 잠재력, 수송 활성 및 TEER 값 ~2000 Ω x cm2. BMEC는 갓 코팅 된 콜라겐 / 섬유 네틴 플레이트 또는 냉동 보존에 전달하기 전에 10 일까지 확장됩니다. 이 프로토콜은 iPSC 유래 BMEC를 적어도 한 번 확장하고 통과할 수 있음을 보여줍니다. 그러나, 낮은 TEER 값및 BMEC 마커의 가난한 지역화가 극저온 보존 후에 관찰되었다. BMEC는 다른 세포 유형 (뉴런, 신경교, pericytes)와 공동 배양 실험, 3 차원 뇌 모델 (장기 칩 및 하이드로겔),뇌 오르가노이드의 혈관화, 신경 정신 장애에서 BBB 기능 장애를 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

Introduction

혈액-뇌 장벽 기능
혈액-뇌 장벽 (BBB) 뇌에 혈액에서 물질의 움직임을 제한 하는 경계를 형성. BBB는 혈관을 안대기하는 단층층을 형성하는 뇌 미세 혈관 내피 세포 (BMEC)로 구성됩니다. BMEC는 성상 세포, 뉴런, pericytes, microglia 및 세포외 매트릭스와 함께 신경 혈관 단위를 형성합니다. BMEC는 BBB가 고트랜스 내피성 내피성 내성(TEER)을 유지할 수 있도록 엄격하게 조절된 파라세포 구조를 가지며, 이는 수동 확산을 제한하고 장벽 무결성1,2의지표역할을 한다. BMEC는 또한 면역 반응 도중 백혈구의 사치뿐만 아니라 내분비증, transcytosis 및 환원과 같은 세포간 운동을 지원하는 단백질이있습니다 3. BMEC는 뇌3의동종 성 균형을 유지하기 위해 폐기물의 영양 및 제거를위한 유입 및 efflux 수송에 의존합니다. 예를 들어, solute carrier family 2 멤버 1(SLC2A1)은 BBB4를가로지르는 포도당의 이동을 담당하는 유입 수송기이며, ATP 결합 카세트 서브패밀리 B 멤버 1(ABCB1) 및 ATP 결합 카세트 서브패밀리 C멤버 1(ABCC1)과 같은 efflux 수송기는 기판을혈류량3,5,6, 7,7, 7, 7, 7, 7, 7, 6, 7로되돌리는 역할을 한다. ABCB1 기판에는 모르핀, 베라파밀4,그리고 올란자핀 과 리스페리돈8과같은 항정신병제를 포함하고 있으며, ABCC1 수송기는 황산염 침추, 빈크리스틴 및 글루큐로니드 컨쥬게이트4를포함한 다양한 기판을 가지고 있다.

정신 장애에서 BBB 모델의 응용 프로그램
BBB 기능 장애는 정신 분열증과 양극성 장애9,10을포함하여 다수의 신경 및 정신 장애에 연루되었습니다. 최근에는 iPSC 유래 전 생체내 세포 모델이 정신 질환의 세포 및 분자 기초를 심문하는 데 활용되고 있지만, 이들 모델은 현재 신경혈관수(11,12,13)에의해 잠재적인 역할을 고려하지 않고 있다. 혈액에서 순환하는 말초 염증 성 사이토카인이 BBB 14,15,16,17에부정적인 영향을 줄 수 있지만, 세포세포18,19,20,21,22,세포간23,24,25, 25,26,27,28, 29,및 외세포 매트릭스 20,29,29,및 외세포 매트릭스20,29, 39이상을 기여하는 증거가 있다고 가설된다. BBB의 중단은 뇌 완두콩에 들어가는 혈액의 내용이 생상세포 및/또는 마이크로글리아를 활성화하여 염증성 사이토카인을 방출하는 결과를 초래할 수 있으며, 이는 차례로 뇌에 해로운 영향을 미칠 수 있는 염증 반응33을 개시한다. BMEC는 BBB의 주요 구성 요소이며 이러한 세포의 구조와 기능을 검사하면 신경 및 정신 장애에서 BBB 기능 장애에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.

대체 BMEC 모델
iPSC1,6,35,36에서BMEC를 도출하기위한 효율적인 프로토콜의 개발에 앞서 연구자들은 BBB 기능을 연구하기 위해 불멸의 BMEC37을 사용했습니다. 그러나, 이들 모델의 대부분은 바람직한 BBB 표현형을 달성하지 못했으며, 이러한 생리학적 범위의 TEER값(38,39). iPSC를 활용하는 것은 세포가 파생되는 개별의 유전적 배경을 유지하는 장점이 있다. 과학자들은 인체 뇌의 구조와 기능을 재구성하는 iPSC 유래 ex vivo 마이크로 환경 모델을 확립하기 위해 적극적으로 노력하고 있습니다. 연구원은 생체 내에서 발견되는 BMEC와 구조적이고 생리적으로 유사한 BMEC를 파생시키는 방법을 개발했습니다. iPSC 유래 BMEC의 정제된 인구를 획득하는 방법은 지난 몇 년 동안최적화되는프로토콜과 다른 단계의 숫자를 필요로1,6,35,36. 일반적으로 iPSC 유래 BMEC는 4일 동안 에센셜 6(E6) 배지에서 배양되며, 그 다음으로 기본적인 섬유아세포 성장인자(bFGF), 망막산(RA) 및 B27 보충제로 보충된 인간 내피 혈청 프리 배지(hESFM)에서 2일 간 배양된다. 세포는 콜라겐 IV (COL4) 및 섬유 넥틴 (FN) 매트릭스에 배양되어 >90 % 균질 BMEC1을얻습니다.

BMEC의 정체는 혈소판-내피 세포 접착 분자-1(PECAM1), SLC2A1 및 타이트 접합 단백질 1(TJP1), 클로르딘(OCLN), 클라딘-5(CLDN5) 및 클라딘-5(CLDN5)와 같은 단단한접합 단백질을 포함하는 BMEC 단백질의 공동 발현을 보여주는 면역형광에 의해 확인된다. 발아 된 술은 iPSC 유래 BMEC의 혈관 신생 잠재력을 확인하는 데 사용되었습니다. 6 BMEC의 BBB 무결성은 체외 TEER 값(~2000Ω x cm2)37 및 ABCB1 및 ABCC11,6,36과같은 efflux 수송자에 대한 측정 가능한 활동의 존재에 의해 평가된다. Lippmann 그룹에 의한 최근의 방법론적 진보는 iPSC 유래 BMEC 프로토콜로 이어졌으며 실험 가변성을 감소시키고 재현성을향상시켰습니다. 그러나 하위 배양 단계를 넘어 확장되고 통과 될 수 있는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 당사의 수정된 프로토콜은 iPSC에서 파생된 BMEC를 8일째 이후로 통과시키고 냉동 보존 후 BBB 특성을 유지하기 위해 더 확장될 수 있는지 여부를 평가하여 이 문제를 해결하는 것을 목표로 합니다. iPSC 유래 BMEC의 패싱을 설명한 연구는 없지만, 동결 해동주기(40)를겪은 후 생리적 BBB 특성을 유지하는 BMEC 냉동 보존에 대한 프로토콜이 존재한다. 그러나, 동결 후 BMEC는 BBB 속성을 통과하고 유지할 수 있다는 것은 알려져 있지 않다.

Lippmann 프로토콜을 사용하여 iPSC에서 파생된 BMEC는 헌팅턴병7과같은 신경 장애의 BBB 중단을 모델링하는 데 활용되었다. 이러한 iPSC 유래 BMEC는 또한 혈액-CSF 장벽 및 BBB의 중단에 Neisseria 뇌막염 또는 B 연쇄상 구균과 같은 세균 감염의 효력을 각각41,42에조사하는 데 사용되었습니다. 또한, 정신 분열증을 가진 22q 삭제 증후군 환자에서 iPSC 유래 BMEC를 사용하여, 연구원은 뇌로 백혈구의 모집 및 사치를 돕는 BMECs에 있는 주요 접착 분자-1 (ICAM-1)의 증가를 관찰했습니다43. 종합하면, 이 연구 결과는 복잡한 신경 정신병 장애에 있는 BBB 중단을 공부하기 위한 iPSC 파생한 BMECs의 유용성을 보여줍니다.

Protocol

인간 iPSCs는 매사추세츠 종합 병원 및 맥린 병원의 기관 검토 위원회에 의해 승인된 프로토콜을 사용하여 건강한 기증자의 섬유아세포에서 재프로그래밍되고, 이전 연구결과 44,45,46에기술된 것과 같이 특징지어졌습니다. 참고 : 간단히, 섬유 아세포는 mRNA 기반의 유전자 재프로그래밍(47)을</su…

Representative Results

BMEC 차별화이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계를 정확하게 따라야합니다(그림 1). 1일째에 E6 배지 사용은 여러세포주(36)에걸쳐 재현 가능한 결과를 산출하는 비교적 짧은 기간 내에 iPSC로부터 신경 절제술 혈통을 유도하는 데 자주 사용되기 때문에 중요하다. 또 다른 중요한 단계는 E6 배지를 희석 (1:200) B27, 20 ng /mL bFGF 및 10 μM RA로 hESFM로 전?…

Discussion

수정 및 문제 해결

본 프로토콜에서, 우리는 BMEC의 파생을 위해 iPSC 배양 하는 동안 일반적으로 사용되는 세포 외 매트릭스 및 세포 배양 매체를 사용 하 여 몇 가지 수정을 했다(그림 1). 이러한 변화는 Lippmann 프로토콜1에설명된 바와 같이 인간 iPSC로부터 BMECS를 파생하는 기능에 영향을 미치지 않았다. 다른 건강한 기증자의…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 혁신적인 새로운 과학자에 대한 정신 건강 생물 행동 연구 상국립 연구소에 의해 지원되었다 (BRAINS) 상 R01MH113858 (R.K.), 건강의 국립 연구소 상 KL2 TR002542 (PL). 국립 정신 건강 임상 과학자 개발 상 K08MH086846 (R.K.), 시드니 R Baer Jr 재단 보조금 (P.L.) 도리스 듀크 자선 재단 임상 과학자 개발 상 (R.K.), 라이언 리히트 상 양극성 재단 (R.K.), 필리스 & 제롬 라일 라파포트 재단 (R.K.), 하버드 줄기 세포 연구소 (R.K.) 및 스티브 윌리스와 엘리사 프로이트 (R.K.에). 애니 카투리아 박사님의 비판적 독서와 원고에 대한 피드백에 감사드립니다.

Materials

2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254
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References

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Brain Microvascular Endothelial CellsHuman Induced Pluripotent Stem CellsBlood-brain BarrierBMEC DerivationBMEC ExpansionBMEC CryopreservationBMEC CharacterizationTEER AnalysisEfflux Transporter ActivityDisease Modeling
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Citer Cet Article
Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).
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