Un pipeline bioinformatique pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression génique à l’aide de l’ARN-seq
Summary
Le but de ce protocole est d’étudier l’évolution et l’expression des gènes candidats à l’aide de données de séquençage de l’ARN.
Abstract
Distiller et signaler de grands ensembles de données, tels que des données sur le génome entier ou le transcriptome, est souvent une tâche ardue. Une façon de décomposer les résultats est de se concentrer sur une ou plusieurs familles de gènes qui sont importantes pour l’organisme et l’étude. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes bioinformatiques pour générer une phylogénie et quantifier l’expression des gènes d’intérêt. Les arbres phylogénétiques peuvent donner un aperçu de l’évolution des gènes au sein des espèces et entre elles, ainsi que révéler l’orthologie. Ces résultats peuvent être améliorés en utilisant des données RNA-seq pour comparer l’expression de ces gènes dans différents individus ou tissus. Les études de l’évolution et de l’expression moléculaires peuvent révéler des modes d’évolution et de conservation de la fonction des gènes entre les espèces. La caractérisation d’une famille de gènes peut servir de tremplin pour de futures études et peut mettre en évidence une famille de gènes importante dans un nouveau génome ou un nouvel article de transcriptome.
Introduction
Les progrès des technologies de séquençage ont facilité le séquençage des génomes et des transcriptomes d’organismes non modèles. En plus de la faisabilité accrue du séquençage de l’ADN et de l’ARN de nombreux organismes, une abondance de données est accessible au public pour étudier les gènes d’intérêt. Le but de ce protocole est de fournir des étapes bioinformatiques pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression des gènes qui peuvent jouer un rôle important dans l’organisme d’intérêt.
L’étude de l’évolution d’un gène ou d’une famille de gènes peut donner un aperçu de l’évolution des systèmes biologiques. Les membres d’une famille de gènes sont généralement déterminés en identifiant des motifs conservés ou des séquences de gènes homologues. L’évolution de la famille de gènes a été précédemment étudiée à l’aide de génomes provenant d’organismes modèles lointainement apparentés1. Une limite à cette approche est qu’il n’est pas clair comment ces familles de gènes évoluent chez des espèces étroitement apparentées et le rôle des différentes pressions sélectives environnementales. Dans ce protocole, nous incluons une recherche d’homologues chez des espèces étroitement apparentées. En générant une phylogénie au niveau de l’embranchement, nous pouvons noter des tendances dans l’évolution de la famille de gènes tels que celle des gènes conservés ou des duplications spécifiques à la lignée. À ce niveau, nous pouvons également étudier si les gènes sont des orthologues ou des paralogues. Bien que de nombreux homologues fonctionnent probablement de manière similaire les uns aux autres, ce n’est pas nécessairement le cas2. L’incorporation d’arbres phylogénétiques dans ces études est importante pour déterminer si ces gènes homologues sont des orthologues ou non. Chez les eucaryotes, de nombreux orthologues conservent des fonctions similaires au sein de la cellule, comme en témoigne la capacité des protéines de mammifères à restaurer la fonction des orthologues de levure3. Cependant, il existe des cas où un gène non orthologue effectue une fonction caractérisée4.
Les arbres phylogénétiques commencent à délimiter les relations entre les gènes et les espèces, mais la fonction ne peut pas être attribuée uniquement en fonction des relations génétiques. Les études d’expression génique combinées aux annotations fonctionnelles et à l’analyse de l’enrichissement fournissent un solide soutien à la fonction des gènes. Les cas où l’expression des gènes peut être quantifiée et comparée entre les individus ou les types de tissus peuvent être plus révélateurs de la fonction potentielle. Le protocole suivant suit les méthodes utilisées dans l’étude des gènes de l’opsine dans Hydra vulgaris7, mais ils peuvent être appliqués à n’importe quelle espèce et n’importe quelle famille de gènes. Les résultats de ces études fournissent une base pour une étude plus approfondie de la fonction des gènes et des réseaux de gènes dans les organismes non modèles. A titre d’exemple, l’étude de la phylogénie des opsines, qui sont des protéines qui initient la cascade de phototransduction, donne un contexte à l’évolution de la détection des yeux et de la lumière8,9,10,11. Dans ce cas, des organismes non modèles en particulier des espèces animales basales telles que les cnidaires ou les cténophores peuvent élucider la conservation ou les changements dans la cascade de phototransduction et la vision à travers les clades12,13,14. De même, la détermination de la phylogénie, de l’expression et des réseaux d’autres familles de gènes nous renseignera sur les mécanismes moléculaires sous-jacents aux adaptations.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le but de ce protocole est de fournir un aperçu des étapes pour caractériser une famille de gènes en utilisant des données RNA-seq. Il a été prouvé que ces méthodes fonctionnent pour une variété d’espèces et d’ensembles de données4,34,35. Le pipeline établi ici a été simplifié et devrait être assez facile à suivre par un novice en bioinformatique. L’importance du protocole est qu’il décrit toutes les …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad et Aline G. Rangel pour leurs conseils et leurs conseils dans l’intégration de certaines de ces étapes dans notre flux de travail. Nous sommes également reconnaissants à Katherine Williams, Elisabeth Rebboah et Natasha Picciani pour leurs commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu en partie par une bourse de recherche médicale de la Fondation George E. Hewitt à A.M.M.
Materials
| Bioanalyzer-DNA kit | Agilent | 5067-4626 | wet lab materials |
| Bioanalyzer-RNA kit | Agilent | 5067-1513 | wet lab materials |
| BLAST+ v. 2.8.1 | On computer cluster* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ |
||
| Blast2GO (on your PC) | On local computer https://www.blast2go.com/b2g-register-basic |
||
| boost v. 1.57.0 | On computer cluster | ||
| Bowtie v. 1.0.0 | On computer cluster https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/ |
||
| Computing cluster (highly recommended) | NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large. | ||
| Cufflinks v. 2.2.1 | On computer cluster | ||
| edgeR v. 3.26.8 (in R) | In Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html |
||
| gcc v. 6.4.0 | On computer cluster | ||
| Java v. 11.0.2 | On computer cluster | ||
| MEGA7 (on your PC) | On local computer https://www.megasoftware.net |
||
| MEGAX v. 0.1 | On local computer https://www.megasoftware.net |
||
| NucleoSpin RNA II kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | wet lab materials |
| perl 5.30.3 | On computer cluster | ||
| python | On computer cluster | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | wet lab materials |
| R v.4.0.0 | On computer cluster https://cran.r-project.org/src/base/R-4/ |
||
| RNAlater | ThermoFisher | AM7021 | wet lab materials |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | wet lab materials |
| RSEM v. 1.3.0 | Computer software https://deweylab.github.io/RSEM/ |
||
| RStudio v. 1.2.1335 | On local computer https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download |
||
| Samtools v. 1.3 | Computer software | ||
| SRA Toolkit v. 2.8.1 | On computer cluster https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit |
||
| STAR v. 2.6.0c | On computer cluster https://github.com/alexdobin/STAR |
||
| StringTie v. 1.3.4d | On computer cluster https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/ |
||
| Transdecoder v. 5.5.0 | On computer cluster https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases |
||
| Trimmomatic v. 0.35 | On computer cluster http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic |
||
| Trinity v.2.8.5 | On computer cluster https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases |
||
| TRIzol | ThermoFisher | 15596018 | wet lab materials |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | wet lab materials |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | wet lab materials |
| *Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator. |
References
- Lespinet, O., Wolf, Y. I., Koonin, E. V., Aravind, L. The role of lineage-specific gene family expansion in the evolution of eukaryotes. Genome Research. 12 (7), 1048-1059 (2002).
- Gabaldón, T., Koonin, E. V. Functional and evolutionary implications of gene orthology. Nature Reviews Genetics. 14 (5), 360-366 (2013).
- Dolinski, K., Botstein, D. Orthology and Functional Conservation in Eukaryotes. Annual Review of Genetics. 41 (1), (2007).
- Macias-Muñoz, A., McCulloch, K. J., Briscoe, A. D. Copy number variation and expression analysis reveals a non-orthologous pinta gene family member involved in butterfly vision. Genome Biology and Evolution. 9 (12), 3398-3412 (2017).
- Cannon, S. B., Mitra, A., Baumgarten, A., Young, N. D., May, G. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families in Arabidopsis thaliana. BMC plant biology. 4, 10 (2004).
- Eastman, S. D., Chen, T. H. P., Falk, M. M., Mendelson, T. C., Iovine, M. K. Phylogenetic analysis of three complete gap junction gene families reveals lineage-specific duplications and highly supported gene classes. Genomics. 87 (2), 265-274 (2006).
- Macias-Munõz, A., Murad, R., Mortazavi, A. Molecular evolution and expression of opsin genes in Hydra vulgaris. BMC Genomics. 20 (1), 1-19 (2019).
- Hisatomi, O., Tokunaga, F. Molecular evolution of proteins involved in vertebrate phototransduction. Comparative Biochemistry and Physiology – B Biochemistry and Molecular Biology. 133 (4), 509-522 (2002).
- Arendt, D. Evolution of eyes and photoreceptor cell types. International Journal of Developmental Biology. 47, 563-571 (2003).
- Shichida, Y., Matsuyama, T. Evolution of opsins and phototransduction. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1531), 2881-2895 (2009).
- Porter, M. L., et al. Shedding new light on opsin evolution. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1726), 3-14 (2012).
- Plachetzki, D. C., Degnan, B. M., Oakley, T. H. The origins of novel protein interactions during animal opsin evolution. PLoS ONE. 2 (10), 1054 (2007).
- Ramirez, M. D., et al. The last common ancestor of most bilaterian animals possessed at least nine opsins. Genome Biology and Evolution. 8 (12), 3640-3652 (2016).
- Schnitzler, C. E., et al. Genomic organization, evolution, and expression of photoprotein and opsin genes in Mnemiopsis leidyi: a new view of ctenophore photocytes. BMC Biology. 10, 107 (2012).
- Pedersen, K. B., Williams, A., Watt, J., Ronis, M. J. Improved method for isolating high-quality RNA from mouse bone with RNAlater at room temperature. Bone Reports. 11, 100211 (2019).
- Ridgeway, J. A., Timm, A. E., Fallon, A. Comparison of RNA isolation methods from insect larvae. Journal of Insect Science. 14 (1), 4-8 (2014).
- Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-Seq: Implications for differential expression and meta-Analyses. BMC Genomics. 21 (1), 1-9 (2020).
- Briscoe, A. D., et al. Female behaviour drives expression and evolution of gustatory receptors in butterflies. PLoS genetics. 9 (7), 1003620 (2013).
- Murad, R., Macias-Muñoz, A., Wong, A., Ma, X., Mortazavi, A. Integrative analysis of Hydra head regeneration reveals activation of distal enhancer-like elements. bioRxiv. , 544049 (2019).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. Impact of RNA degradation on measurements of gene expression. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Trinity. . RNA-Seq De novo Assembly Using Trinity. , 1-7 (2014).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
- Li, B., Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC bioinformatics. 12, 323 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25 (2009).
- Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10, 421 (2009).
- Conesa, A., Götz, S. Blast2GO: A comprehensive suite for functional analysis in plant genomics. International Journal of Plant Genomics. 619832, (2008).
- Conesa, A., et al. Blast2GO: A universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research. Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).
- Götz, S., et al. High-throughput functional annotation and data mining with the Blast2GO suite. Nucleic Acids Research. 36 (10), 3420-3435 (2008).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular biology and evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Edgar, R. C. MUSCLE: Multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- Taddei-Ferretti, C., Musio, C., Santillo, S., Cotugno, A. The photobiology of Hydra’s periodic activity. Hydrobiologia. 530, 129-134 (2004).
- Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464 (7288), 592-596 (2010).
- Macias-Muñoz, A., Rangel Olguin, A. G., Briscoe, A. D. Evolution of phototransduction genes in Lepidoptera. Genome Biology and Evolution. 11 (8), 2107-2124 (2019).
- Macias-Munõz, A., Murad, R., Mortazavi, A. Molecular evolution and expression of opsin genes in Hydra vulgaris. BMC Genomics. 20 (1), (2019).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Tavares, L., Alves, P. M., Ferreira, R. B., Santos, C. N. Comparison of different methods for DNA-free RNA isolation from SK-N-MC neuroblastoma. BMC research notes. 4, 3 (2011).
- Johnson, M. T. J., et al. Evaluating Methods for Isolating Total RNA and Predicting the Success of Sequencing Phylogenetically Diverse Plant Transcriptomes. PLoS ONE. 7 (11), (2012).
- Zhao, S., Zhang, Y., Gamini, R., Zhang, B., Von Schack, D. Evaluation of two main RNA-seq approaches for gene quantification in clinical RNA sequencing: PolyA+ selection versus rRNA depletion. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
- Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNA-seq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16 (1), 1-14 (2015).
- Corley, S. M., MacKenzie, K. L., Beverdam, A., Roddam, L. F., Wilkins, M. R. Differentially expressed genes from RNA-Seq and functional enrichment results are affected by the choice of single-end versus paired-end reads and stranded versus non-stranded protocols. BMC Genomics. 18 (1), 1-13 (2017).
- Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8 (8), 1494-1512 (2013).
- Pertea, M., et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature biotechnology. 33 (3), 290-295 (2015).
- Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification. Nature Biotechnology. 34 (5), 525-527 (2016).
- Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Araujo, F. A., Barh, D., Silva, A., Guimarães, L., Thiago, R. . OPEN GO FEAT a rapid web-based functional annotation tool for genomic and transcriptomic data. , 8-11 (2018).
- Huerta-Cepas, J., et al. Fast genome-wide functional annotation through orthology assignment by eggNOG-mapper. Molecular Biology and Evolution. 34 (8), 2115-2122 (2017).
- Huerta-Cepas, J., et al. EggNOG 5.0: A hierarchical, functionally and phylogenetically annotated orthology resource based on 5090 organisms and 2502 viruses. Nucleic Acids Research. 47, 309-314 (2019).
- Törönen, P., Medlar, A., Holm, L. PANNZER2: A rapid functional annotation web server. Nucleic Acids Research. 46, 84-88 (2018).
- Robinson, M., Mccarthy, D., Chen, Y., Smyth, G. K. . edgeR differential expression analysis of digital gene expression data User’s Guide. , (2013).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: Paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).
- Letunic, I., Bork, P. Interactive tree of life (iTOL) v3: an online tool for the display and annotation of phylogenetic and other trees. Nucleic acids research. 44, 242-245 (2016).
