צינור ביואינפורמטיקה לחקירת אבולוציה מולקולרית וביטוי גנים באמצעות RNA-seq
Summary
מטרת פרוטוקול זה היא לחקור את האבולוציה והביטוי של גנים מועמדים באמצעות נתוני רצף RNA.
Abstract
זיקוק ודיווח על ערכות נתונים גדולות, כגון נתוני גנום שלם או תעתיק, הוא לעתים קרובות משימה מרתיעה. אחת הדרכים לפרק את התוצאות היא להתמקד במשפחות גנים אחת או יותר שהן משמעותיות לאורגניזם ולחימוד. בפרוטוקול זה, אנו מתארים צעדים ביואינפורמטיים כדי ליצור פילוגנית ולכמת את הביטוי של גנים מעניינים. עצים פילוגנטיים יכולים לתת תובנה כיצד גנים מתפתחים בתוך ובין מינים, כמו גם לחשוף אורתולוגיה. תוצאות אלה ניתן לשפר באמצעות נתוני RNA-seq כדי להשוות את הביטוי של גנים אלה אצל אנשים שונים או רקמות. מחקרים על אבולוציה מולקולרית וביטוי יכולים לחשוף דרכי אבולוציה ושימור של תפקוד גנים בין מינים. אפיון משפחת גנים יכול לשמש כקרש קפיצה למחקרים עתידיים ויכול להדגיש משפחת גנים חשובה בנייר גנום או שעתוק חדש.
Introduction
ההתקדמות בטכנולוגיות הרצף אפשרה רצף של גנומים ותעתיקים של אורגניזמים שאינם מודלים. בנוסף להיתכנות המוגברת של רצף DNA ו- RNA מאורגניזמים רבים, שפע של נתונים זמין לציבור כדי לחקור גנים מעניינים. מטרת פרוטוקול זה היא לספק צעדים ביואינפורמטיים כדי לחקור את האבולוציה המולקולרית ואת הביטוי של גנים שעשויים לשחק תפקיד חשוב באורגניזם של עניין.
חקירת האבולוציה של גן או משפחת גנים יכולה לספק תובנה על האבולוציה של מערכות ביולוגיות. בני משפחת גנים נקבעים בדרך כלל על ידי זיהוי מוטיבים שמורים או רצפי גנים הומולוגיים. האבולוציה של משפחת הגנים נחקרה בעבר באמצעות גנומים מאורגניזמים מודלים הקשורים מרחוק1. מגבלה לגישה זו היא שלא ברור כיצד משפחות גנים אלה מתפתחות במינים קרובים ותפקידם של לחצים סלקטיביים סביבתיים שונים. בפרוטוקול זה, אנו כוללים חיפוש אחר הומולוגים במינים קרובים. על ידי יצירת פילוגנית ברמת פילום, אנו יכולים לציין מגמות באבולוציה של משפחת גנים כגון זו של גנים שמורים או כפילויות ספציפיות לשושלת. ברמה זו, אנו יכולים גם לחקור אם גנים הם אורתולוגים או paralogs. בעוד homologs רבים סביר לתפקד באופן דומה זה לזה, זה לא בהכרח המקרה2. שילוב עצים פילוגנטיים במחקרים אלה חשוב לפתור אם גנים הומולוגיים אלה הם אורתולוגים או לא. באיקריוטים, אורתולוגים רבים שומרים על תפקודים דומים בתוך התא כפי שמעידים היכולת של חלבוני יונקים לשחזר את תפקודם של אורתולוגים שמרים3. עם זאת, ישנם מקרים שבהם גן לא אורתולוגי מבצע פונקציה מאופיינת4.
עצים פילוגנטיים מתחילים לתוות יחסים בין גנים ומינים, אך לא ניתן להקצות את הפונקציה אך ורק על סמך יחסים גנטיים. מחקרי ביטוי גנים בשילוב עם ביאורים תפקודיים וניתוח העשרה מספקים תמיכה חזקה לתפקוד הגנים. מקרים שבהם ביטוי גנים ניתן לכמת ולהשוות בין אנשים או סוגי רקמות יכול להיות יותר לספר על תפקוד פוטנציאלי. הפרוטוקול הבא עוקב אחר שיטות המשמשות בחקירת גנים opsin ב הידרה וולגריס7, אבל הם יכולים להיות מיושמים על כל מין וכל משפחת גנים. התוצאות של מחקרים כאלה מספקות בסיס להמשך חקירה של תפקוד גנים ורשתות גנים באורגניזמים שאינם מודלים. כדוגמה, החקירה של פילוגנטיה של opsins, שהם חלבונים היוזמים את מפל phototransduction, נותן הקשר האבולוציה של העיניים וזיהוי אור8,9,10,11. במקרה זה, אורגניזמים שאינם מודל במיוחד מיני בעלי חיים בסיסיים כגון cnidarians או ctenophores יכול להבהיר שימור או שינויים מפל phototransduction וראייה על פני clades12,13,14. באופן דומה, קביעת הפילוגניות, הביטוי והרשתות של משפחות גנים אחרות תודיע לנו על המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההתאמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטרת פרוטוקול זה היא לספק מתווה של השלבים לאפיון משפחת גנים באמצעות נתוני RNA-seq. שיטות אלה הוכחו לעבוד עבור מגוון רחב של מינים datasets4,34,35. הצינור שהוקם כאן כבר מפושט צריך להיות קל מספיק כדי להיות מלווה טירון בביואינפורמטיקה. משמעות הפרוטוקול…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאדריאנה בריסקו, גיל סמית’, רבי מוראד ואלין ג’ ריינג’ל על ייעוץ והדרכה בשילוב חלק מהשלבים הללו בזרימת העבודה שלנו. אנו מודים גם לקתרין ויליאמס, אליזבת רבואה ונטשה פיצ’יאני על הערות על כתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן ג’ורג’ א. יואיט למלגת מחקר רפואי ל- A.M.M.
Materials
| Bioanalyzer-DNA kit | Agilent | 5067-4626 | wet lab materials |
| Bioanalyzer-RNA kit | Agilent | 5067-1513 | wet lab materials |
| BLAST+ v. 2.8.1 | On computer cluster* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ |
||
| Blast2GO (on your PC) | On local computer https://www.blast2go.com/b2g-register-basic |
||
| boost v. 1.57.0 | On computer cluster | ||
| Bowtie v. 1.0.0 | On computer cluster https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/ |
||
| Computing cluster (highly recommended) | NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large. | ||
| Cufflinks v. 2.2.1 | On computer cluster | ||
| edgeR v. 3.26.8 (in R) | In Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html |
||
| gcc v. 6.4.0 | On computer cluster | ||
| Java v. 11.0.2 | On computer cluster | ||
| MEGA7 (on your PC) | On local computer https://www.megasoftware.net |
||
| MEGAX v. 0.1 | On local computer https://www.megasoftware.net |
||
| NucleoSpin RNA II kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | wet lab materials |
| perl 5.30.3 | On computer cluster | ||
| python | On computer cluster | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | wet lab materials |
| R v.4.0.0 | On computer cluster https://cran.r-project.org/src/base/R-4/ |
||
| RNAlater | ThermoFisher | AM7021 | wet lab materials |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | wet lab materials |
| RSEM v. 1.3.0 | Computer software https://deweylab.github.io/RSEM/ |
||
| RStudio v. 1.2.1335 | On local computer https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download |
||
| Samtools v. 1.3 | Computer software | ||
| SRA Toolkit v. 2.8.1 | On computer cluster https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit |
||
| STAR v. 2.6.0c | On computer cluster https://github.com/alexdobin/STAR |
||
| StringTie v. 1.3.4d | On computer cluster https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/ |
||
| Transdecoder v. 5.5.0 | On computer cluster https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases |
||
| Trimmomatic v. 0.35 | On computer cluster http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic |
||
| Trinity v.2.8.5 | On computer cluster https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases |
||
| TRIzol | ThermoFisher | 15596018 | wet lab materials |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | wet lab materials |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | wet lab materials |
| *Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator. |
References
- Lespinet, O., Wolf, Y. I., Koonin, E. V., Aravind, L. The role of lineage-specific gene family expansion in the evolution of eukaryotes. Genome Research. 12 (7), 1048-1059 (2002).
- Gabaldón, T., Koonin, E. V. Functional and evolutionary implications of gene orthology. Nature Reviews Genetics. 14 (5), 360-366 (2013).
- Dolinski, K., Botstein, D. Orthology and Functional Conservation in Eukaryotes. Annual Review of Genetics. 41 (1), (2007).
- Macias-Muñoz, A., McCulloch, K. J., Briscoe, A. D. Copy number variation and expression analysis reveals a non-orthologous pinta gene family member involved in butterfly vision. Genome Biology and Evolution. 9 (12), 3398-3412 (2017).
- Cannon, S. B., Mitra, A., Baumgarten, A., Young, N. D., May, G. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families in Arabidopsis thaliana. BMC plant biology. 4, 10 (2004).
- Eastman, S. D., Chen, T. H. P., Falk, M. M., Mendelson, T. C., Iovine, M. K. Phylogenetic analysis of three complete gap junction gene families reveals lineage-specific duplications and highly supported gene classes. Genomics. 87 (2), 265-274 (2006).
- Macias-Munõz, A., Murad, R., Mortazavi, A. Molecular evolution and expression of opsin genes in Hydra vulgaris. BMC Genomics. 20 (1), 1-19 (2019).
- Hisatomi, O., Tokunaga, F. Molecular evolution of proteins involved in vertebrate phototransduction. Comparative Biochemistry and Physiology – B Biochemistry and Molecular Biology. 133 (4), 509-522 (2002).
- Arendt, D. Evolution of eyes and photoreceptor cell types. International Journal of Developmental Biology. 47, 563-571 (2003).
- Shichida, Y., Matsuyama, T. Evolution of opsins and phototransduction. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1531), 2881-2895 (2009).
- Porter, M. L., et al. Shedding new light on opsin evolution. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1726), 3-14 (2012).
- Plachetzki, D. C., Degnan, B. M., Oakley, T. H. The origins of novel protein interactions during animal opsin evolution. PLoS ONE. 2 (10), 1054 (2007).
- Ramirez, M. D., et al. The last common ancestor of most bilaterian animals possessed at least nine opsins. Genome Biology and Evolution. 8 (12), 3640-3652 (2016).
- Schnitzler, C. E., et al. Genomic organization, evolution, and expression of photoprotein and opsin genes in Mnemiopsis leidyi: a new view of ctenophore photocytes. BMC Biology. 10, 107 (2012).
- Pedersen, K. B., Williams, A., Watt, J., Ronis, M. J. Improved method for isolating high-quality RNA from mouse bone with RNAlater at room temperature. Bone Reports. 11, 100211 (2019).
- Ridgeway, J. A., Timm, A. E., Fallon, A. Comparison of RNA isolation methods from insect larvae. Journal of Insect Science. 14 (1), 4-8 (2014).
- Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-Seq: Implications for differential expression and meta-Analyses. BMC Genomics. 21 (1), 1-9 (2020).
- Briscoe, A. D., et al. Female behaviour drives expression and evolution of gustatory receptors in butterflies. PLoS genetics. 9 (7), 1003620 (2013).
- Murad, R., Macias-Muñoz, A., Wong, A., Ma, X., Mortazavi, A. Integrative analysis of Hydra head regeneration reveals activation of distal enhancer-like elements. bioRxiv. , 544049 (2019).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. Impact of RNA degradation on measurements of gene expression. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Trinity. . RNA-Seq De novo Assembly Using Trinity. , 1-7 (2014).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
- Li, B., Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC bioinformatics. 12, 323 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25 (2009).
- Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10, 421 (2009).
- Conesa, A., Götz, S. Blast2GO: A comprehensive suite for functional analysis in plant genomics. International Journal of Plant Genomics. 619832, (2008).
- Conesa, A., et al. Blast2GO: A universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research. Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).
- Götz, S., et al. High-throughput functional annotation and data mining with the Blast2GO suite. Nucleic Acids Research. 36 (10), 3420-3435 (2008).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular biology and evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Edgar, R. C. MUSCLE: Multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- Taddei-Ferretti, C., Musio, C., Santillo, S., Cotugno, A. The photobiology of Hydra’s periodic activity. Hydrobiologia. 530, 129-134 (2004).
- Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464 (7288), 592-596 (2010).
- Macias-Muñoz, A., Rangel Olguin, A. G., Briscoe, A. D. Evolution of phototransduction genes in Lepidoptera. Genome Biology and Evolution. 11 (8), 2107-2124 (2019).
- Macias-Munõz, A., Murad, R., Mortazavi, A. Molecular evolution and expression of opsin genes in Hydra vulgaris. BMC Genomics. 20 (1), (2019).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Tavares, L., Alves, P. M., Ferreira, R. B., Santos, C. N. Comparison of different methods for DNA-free RNA isolation from SK-N-MC neuroblastoma. BMC research notes. 4, 3 (2011).
- Johnson, M. T. J., et al. Evaluating Methods for Isolating Total RNA and Predicting the Success of Sequencing Phylogenetically Diverse Plant Transcriptomes. PLoS ONE. 7 (11), (2012).
- Zhao, S., Zhang, Y., Gamini, R., Zhang, B., Von Schack, D. Evaluation of two main RNA-seq approaches for gene quantification in clinical RNA sequencing: PolyA+ selection versus rRNA depletion. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
- Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNA-seq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16 (1), 1-14 (2015).
- Corley, S. M., MacKenzie, K. L., Beverdam, A., Roddam, L. F., Wilkins, M. R. Differentially expressed genes from RNA-Seq and functional enrichment results are affected by the choice of single-end versus paired-end reads and stranded versus non-stranded protocols. BMC Genomics. 18 (1), 1-13 (2017).
- Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8 (8), 1494-1512 (2013).
- Pertea, M., et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature biotechnology. 33 (3), 290-295 (2015).
- Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification. Nature Biotechnology. 34 (5), 525-527 (2016).
- Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Araujo, F. A., Barh, D., Silva, A., Guimarães, L., Thiago, R. . OPEN GO FEAT a rapid web-based functional annotation tool for genomic and transcriptomic data. , 8-11 (2018).
- Huerta-Cepas, J., et al. Fast genome-wide functional annotation through orthology assignment by eggNOG-mapper. Molecular Biology and Evolution. 34 (8), 2115-2122 (2017).
- Huerta-Cepas, J., et al. EggNOG 5.0: A hierarchical, functionally and phylogenetically annotated orthology resource based on 5090 organisms and 2502 viruses. Nucleic Acids Research. 47, 309-314 (2019).
- Törönen, P., Medlar, A., Holm, L. PANNZER2: A rapid functional annotation web server. Nucleic Acids Research. 46, 84-88 (2018).
- Robinson, M., Mccarthy, D., Chen, Y., Smyth, G. K. . edgeR differential expression analysis of digital gene expression data User’s Guide. , (2013).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: Paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).
- Letunic, I., Bork, P. Interactive tree of life (iTOL) v3: an online tool for the display and annotation of phylogenetic and other trees. Nucleic acids research. 44, 242-245 (2016).
