혈액 유래 신경 세포의 GM 무료 생성
Summary
우리는 유전자 변형되지 않은 (GM 무료) 방법을 제시하여 재프로그래밍 된 말초 혈액 세포에서 신경 표현형을 가진 세포를 얻습니다. 새로운 인간 GPI 연결 단백질에 연결 된 신호 경로의 활성화 인간의 다능 한 줄기 세포를 얻기 위한 효율적인 GM 무료 방법을 밝혀.
Abstract
많은 인간 신경 장애는 두뇌에 있는 신경 세포 및 신경교 세포의 변성에 기인합니다. 약리학 및 기타 치료 전략의 한계로 인해 현재 부상또는 병에 걸린 뇌에 사용할 수있는 치료법이 없습니다. 세포 교체는 신경 퇴행성 조건에 대한 유망한 치료 전략으로 나타납니다. 현재까지, 신경 줄기 세포(NSC)는 태아 조직, 인간 배아 세포(ES) 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 성공적으로 생성되었다. 변분화 과정은 다능성 줄기 세포의 생성으로 이어지는 새로운 인간 GPI 연결 당단백질의 활성화에 의해 시작되었다. 이러한 혈액 유래 만능 줄기 세포 (BD-PSC)는 밝은 필드와 면역 형광 현미경 검사법에 의해 나타난 바와 같이 신경 표현형을 가진 세포로 시험관내에서 분화한다. 전자 현미경 검사를 통해 이러한 세포의 초구조적 분석은 그들의 원시 구조뿐만 아니라 뉴런 형 형태와 세포 극성 특성을 확인합니다.
Introduction
기본 및 전임상 줄기 세포 연구 방법의 개발은 신경 질환에 대한 줄기 세포 기반 치료의 임상 적용을 장려합니다. 이러한 잠재적 치료는 기능적 회복1로이어지는 인간 신경 세포의 생성 방법에 비판적으로 의존한다.
신경 줄기 세포 (NSC) 자체 갱신 하 고 성인 신경 발생 이라고 하는 프로세스에 평생 새로운 뉴런으로 분화. 만 매우 제한 된 뇌 영역 은 성인기에 신생아 뉴런을 생성 할 수있는 NsCs를 항구. 이러한 NSC는 학습과 메모리에 관여하는 성숙한 뉴런을 초래할 수 있으므로 분실되거나 손상된 뉴런을 대체할 수 있습니다. 불행하게도, 이러한 NSC는 제한된 양에 존재하고이 제한된 신경 발생은 청소년 발달 동안 급속하게감소2. 따라서 신경 세포의 다른 소스는 세포 치료 목적으로 고려되어야합니다.
퇴행성 신경 질환은 표준 약리학적 접근법을 사용하여 치료하기가 어렵습니다. 많은 치료 신경 장애를 수용 하기위한 새로운 치료 전략은 질병과 부상 조직의 세포 대체 요법에 기초. NSC 이식은 손상된 세포를 대체하고 유익한 효력을 제공할 수 있었습니다. 신경세포 교체를 위한 그밖 근원은 포유류 분폭물3의내세포 질량에서 파생되는 인간 배아 줄기 세포 (ESC) 및 ESC 같이 광대한 자기 갱신 능력을 가지고 있고 각종 세포 혈통으로 분화할 수 있는 iPSCs4를포함합니다. 또한 만능 상태5를피하는 인간 섬유아세포로부터 직접 리프로그래밍하여 NSC를 생성할 수 있다.
세포 대체 요법은 여전히 어려운 문제입니다. ESC, 태아 또는 iPS는 많은 난치성 신경 질환을 치료하기위한 신경 세포의 세대에 대한 소스가 될 수 있지만 손상된 조직의 자가 성 성인 SCs 세포 교체는 면역학적, 윤리적 및 안전 문제를 우회하는 더 나은 대안입니다.
PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN의 인산화를 통해 항체-교차연결에 의한 인간 GPI 연계 단백질의 활성화는 혈액 전구 세포의 비차별화를 시작하고 혈액 유래 만능 줄기 세포(BD-PSC)6. 이 세포는 밝은 필드, 면역 형광 및 전염 전자 현미경 검사 (TEM) 분석을 통해 확인 된 바와 같이 신경 세포를 향해 시험관 내 분화.
이 작품에서 우리는 BD-PSC의 GM 없는 생성 및 그들의 성공적인 재 분화 신경 표현형을 가진 세포로 기술합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 업무에서 기재된 인간 세포를 재프로그래밍하는 비GM 방법은 비조작된 인간 말초 혈액으로부터 얻은 전 생체 생성 및 자가 갱신 PSC의 확장으로 이어지는 비분화 과정을 개시하는 GPI 연계 인간 막 당단백질 의 뒤에 있는 신호(들) 기계류의 핵 활성화에 기초한다. 이러한 세포는 적절한 배지에서 배양될 때 상이한세균층(6)에속하는 세포로 재분화할 수 있다.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
라이너 사프리치 박사의 기억력에 전념합니다.
저자는 특히 호세 마누엘 가르시아 베르두고와 비센테 헤르란츠-페레즈가 비교 신경생물학 연구소, 생물 다양성 및 진화 생물학 연구소, 발렌시아 대학, CIBERNED, 발렌시아, 스페인에서 EM 실험 및 분석을 수행한 것에 대해 특히 감사하고 있으며, 이는 Prometeo Grant의 연구 자금 지원으로 지원되었다. 이 작품의 나머지 는 ACA 셀 생명 공학 GmbH 하이델베르크, 독일에 의해 지원되었다.
Materials
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
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