无转基因生成血液衍生神经元细胞
Summary
我们提出了一种无转基因（无转基因）的方法，从重新编程的周围血细胞中获取具有神经元表型的细胞。激活与新型人类GPI相关蛋白质相关的信号通路，揭示了获得人类多能干细胞的高效无转基因方法。
Abstract
许多人类神经系统疾病是由大脑中神经元和胶质细胞的退化引起的。由于药理学和其他治疗策略的限制，目前没有治疗受伤或患病的大脑的方法。细胞置换似乎是神经退行性疾病的有希望的治疗策略。时至今日，神经干细胞（NSC）已经成功地从胎儿组织、人类胚胎细胞（ES）或诱导多能干细胞（iPSC）中产生。通过激活新的人类GPI相关糖蛋白，导致多能干细胞的产生，启动了分化过程。这些血液衍生的多能干细胞（BD-PSCs） 在体外 分化成具有神经表型的细胞，亮场和免疫荧光显微镜就证明了这一点。通过电子显微镜对这些细胞进行超结构分析，证实了它们的原始结构以及神经元样形态和亚细胞特征。
Introduction
基础和临床前干细胞研究方法的开发鼓励了基于干细胞的神经系统疾病疗法的临床应用。这种潜在的治疗关键取决于人类神经细胞的生成方法，导致功能恢复1。
神经干细胞（NSC）在称为成人神经生成的过程中，自更新并终生分化成新的神经元。只有非常有限的大脑区域才拥有 NSC，能够在成年后产生新生儿神经元。这种 NSC 可以产生成熟的神经元，这些神经元涉及学习和记忆，从而取代丢失或损坏的神经元。不幸的是，这些NSC存在数量有限，这种有限的神经发生在青少年发育过程中迅速减少2。因此，神经细胞的其他来源必须在细胞治疗目标中考虑。
退行性神经系统疾病难以使用标准药理学方法治愈。接受许多不动的神经系统疾病的新治疗策略基于疾病和受伤组织的细胞替代疗法。NSC移植可以取代受损的细胞，并提供有益的效果。神经细胞替代的其他来源包括人类胚胎干细胞（ESC），它来自哺乳动物胚泡3的内细胞质量，以及iPSC4，它们具有广泛的自我更新能力，如ESC，能够分化成不同的细胞谱系。NSC也可以通过直接重新编程从人类成纤维细胞产生，避免多能状态5。
细胞替代疗法仍然是一个具有挑战性的问题。虽然ESC、胎儿或iPS可以成为治疗许多不治之症的神经元细胞的来源，但自体成人SC细胞替代受损组织是规避免疫、伦理和安全问题的更好选择。
通过PLC+/PI3K/Akt/mTor/PTEN的磷酸化，通过抗体交叉链接激活人类GPI相关蛋白质，启动血液祖细胞的分化和血液衍生多能干细胞（BD-PSCs）6的生成。这些细胞通过亮场、免疫荧光和传输电子显微镜 （TEM） 分析确认，在体外向神经元细胞分化。
在这项研究中，我们描述了无转基因的BD-PSCs生成及其成功重新分化成具有神经元表型的细胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
本工作中描述的非转基因人体细胞重新编程方法基于GPI链接的人类膜糖蛋白背后的信号机制的膜到细胞核活化，该机制启动分化过程，导致从非受操纵的人类外周血液中获取的自续PC 的体外 生成和扩展。这些细胞在适当的介质中培养时，能够重新分化成属于不同生殖层6的细胞。
本研究中提供的数据表明，在神经元分化介质中培养时，无转基因生成的…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
献给雷纳·萨弗里希博士的记忆
作者特别感谢何塞·曼努埃尔·加西亚-韦尔杜戈和维森特·赫兰茨-佩雷斯在西班牙瓦伦西亚大学卡瓦尼耶生物多样性和进化生物学研究所比较神经生物学实验室进行EM实验和分析，该实验室得到了普罗梅蒂奥卓越研究团体PROMETEO/2019/075研究资助。这项工作的其余部分得到了德国海德堡ACA CELL生物技术有限公司的支持。
Materials
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
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