GM-fri generation av blodbaserade neuronala celler
Summary
Vi presenterar en genetiskt modifierad-fri (GM-fri) metod för att erhålla celler med en neuronal fenotyp från omprogrammerade perifera blodkroppar. Aktivering av en signalväg kopplad till nytt humant GPI-kopplat protein avslöjar en effektiv GM-fri metod för att erhålla mänskliga pluripotenta stamceller.
Abstract
Många mänskliga neurologiska störningar orsakas av degeneration av nervceller och gliaceller i hjärnan. På grund av begränsningar i farmakologiska och andra terapeutiska strategier finns det för närvarande inget botemedel tillgängligt för den skadade eller sjuka hjärnan. Cell ersättning visas som en lovande terapeutisk strategi för neurodegenerativa villkor. Än i dag har neurala stamceller (NSC) framgångsrikt genererats från fetala vävnader, mänskliga embryonala celler (ES) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSC). En process av dedifferentiation initierades genom aktivering av den nya mänskliga GPI-länkade glykoprotein, vilket leder till generering av pluripotenta stamceller. Dessa blod-härledda pluripotenta stamceller (BD-PSCs) skiljer in vitro till celler med en neural fenotyp som visas av brightfield och immunofluorescens mikroskopi. Strukturella analys av dessa celler med hjälp av elektronmikroskopi bekräftar deras primitiva struktur samt neuronal-liknande morfologi och subcellulära egenskaper.
Introduction
Utveckling av grundläggande och prekliniska stamcellsforskningsmetoder uppmuntrar klinisk tillämpning av stamcellsbaserade terapier för neurologiska sjukdomar. Sådan potentiell terapi beror kritiskt på metoden för generering av mänskliga neurala celler som leder till funktionell återhämtning1.
Neurala stamceller (NSCs) självförnya och differentiera till nya nervceller under hela livet i en process som kallas vuxen neurogenes. Endast mycket begränsade hjärnområden hyser NSCs kompetent att generera nyfödda nervceller i vuxen ålder. Sådana NSCs kan ge upphov till mogna nervceller, som är involverade i lärande och minne, vilket ersätter förlorade eller skadade nervceller. Tyvärr finns dessa NSCs i begränsade mängder och denna begränsade neurogenes minskar snabbt under ungdomsutveckling2. Därför måste andra källor till neurala celler beaktas i ett cellterapimål.
Degenerativa neurologiska sjukdomar är svåra att bota med hjälp av vanliga farmakologiska metoder. Nya terapeutiska strategier för att omfamna många omätbara neurologiska störningar är baserade på cellersättningsterapier av sjuk och skadad vävnad. NSC-transplantation kan ersätta skadade celler och ge positiva effekter. Andra källor för neuralcellsersättning inkluderar mänskliga embryonala stamceller (ESC), som härrör från den inre cellmassan hos däggdjur blastocyster3, liksom iPSCs4, som har omfattande självförnyelsekapacitet som EIC och kan skilja sig åt i olika cellstammar. NSCs kan också genereras genom direkt omprogrammering från mänskliga fibroblaster undvika pluripotent tillstånd5.
Cellersättningsterapi är fortfarande en utmanande fråga. Även om ESC, fetala eller iPS kan vara en källa för generation av neuronala celler för behandling av många obotliga neurologiska sjukdomar, är autolog vuxen SCs cellersättning av skadade vävnader ett bättre alternativ som kringgår immunologiska, etiska och säkerhetsproblem.
Aktivering av humant GPI-kopplat protein genom antikroppskorsning via fosforylering av PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initierar en dedifferentiering av blodavkommaceller och generering av blodbaserade pluripotenta stamceller (BD-PSC)6. Dessa celler skiljer in vitro mot neuronala celler som bekräftas med hjälp av brightfield, immunofluorescens och transmission elektronmikroskopi (TEM) analys.
I detta arbete beskriver vi den GM-fria generationen av BD-PSCs och deras framgångsrika åter differentiering i celler med neuronal fenotyp.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den icke-GM-metod för omprogrammering av mänskliga celler som beskrivs i detta arbete är baserad på membran till kärna aktivering av signaleringsmaskiner bakom det GPI-kopplade mänskliga membranet glykoprotein som initierar dedifferentiationsprocessen som leder till ex vivo-generering och expansion av självförnyande PSC som erhållits från icke-manipulerat mänskligt perifert blod. Dessa celler när de odlas i lämpliga medier kan åter differentieras till celler som tillhör olika bakterielager<sup cla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tillägnad minnet av dr Rainer Saffrich.
Författarna är särskilt tacksamma mot José Manuel García-Verdugo och Vicente Herranz-Pérez för att ha utfört EM-experiment och analyser vid Laboratoriet för jämförande neurobiologi, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, University of Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanien, som stöddes av forskningsfinansiering från Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Resten av detta arbete stöddes av ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Tyskland.
Materials
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
