Vi leverer en protokol til at generere en farmakologisk DYT/PARK-ATP1A3 dystoni musemodel via implantation af kanyler i basale ganglier og lillehjernen forbundet til osmotiske pumper. Vi beskriver induktion af dystoni-lignende bevægelser via anvendelse af en motorisk udfordring og karakterisering af fænotypen via adfærdsmæssige scoringssystemer.
Genetisk modificerede musemodeller har begrænsninger, især når man studerer bevægelsesforstyrrelser, hvor de fleste af de tilgængelige transgene gnavere modeller ikke udgør en motorisk fænotype, der ligner de kliniske aspekter af den menneskelige sygdom. Farmakologiske musemodeller giver mulighed for en mere direkte undersøgelse af pathomechanisms og deres virkning på adfærdsmæssige fænotype. Osmotiske pumper forbundet til hjerne kanyler åbne mulighed for at skabe farmakologiske musemodeller via lokale og kroniske lægemiddellevering. For den arvelige bevægelsesforstyrrelse af hurtig debut dystoni-parkinsonisme, tab-of-funktion mutation i α3-underenhed af Na+/ K+-ATPase kan simuleres ved en meget specifik blokade via glycoside ouabain. For lokalt at blokere α3-underenheden i de basale ganglier og lillehjernen, som er de to hjernestrukturer, der menes at være stærkt involveret i patogenesen af hurtig debut dystoni-parkinsonisme, en bilateral kanyle er stereotaxically implanteret i striatum og en ekstra enkelt kanyle indføres i lillehjernen. Kanylene er forbundet via vinylrør til to osmotiske pumper, som subkutant implanteres på bagsiden af dyrene og giver mulighed for kronisk og præcis levering af ouabain. Den farmakologiske musemodel for hurtig debut dystoni-parkinsonisme bærer den yderligere fordel at opsummere de kliniske og patologiske træk ved asymptomatiske og symptomatiske mutation bærere. Ligesom mutation bærere af hurtig-debut dystoni parkinsonisme, ouabain-perfunderes mus udvikle dystoni-lignende bevægelser kun efter yderligere eksponering for stress. Vi demonstrerer et mildt stressparadigme og indfører to modificerede pointsystemer til vurdering af en motorisk fænotype.
Fordelene ved en kontinuerlig levering af narkotika direkte ind i hjernen er talrige. Gentagne og hyppige injektioner, som repræsenterer en unødvendig stressfaktor for dyr, kan undgås, og der kan opnås en mere konstant intracerebral koncentration af lægemidlet. Dette gælder især, når systemisk administreret medicin undlader nemt at trænge ind i blod-hjerne barrieren. Desuden, kronisk lægemiddellevering via osmotiske pumper giver mulighed for lokaliseret levering af substrater, der ellers ville have hele systemet bivirkninger. Narkotika kan leveres på en målrettet måde til de ønskede hjernestrukturer, den deraf følgende effekt kan således spores direkte. Dette kan udnyttes til en række applikationer, såsom undersøgelse af terapeutiske virkninger samt undersøgelse af pathomechanisms. Denne sidste ansøgning blev brugt i projektet heri for at skabe en farmakologisk musemodel for dystoni.
Analysen og forståelsen af dystonisk syndromer, som repræsenterer den tredje mest almindelige bevægelsesforstyrrelse, har været stærkt begrænset af det faktum, at genetiske dyremodeller stort set undlader at reproducere sygdommen fænotype findes i syge mennesker samt patofysiologi. Dette spørgsmål er ikke begrænset til dystoniske syndromer, men vedrører faktisk mange transgene gnavere modeller inden for bevægelsesforstyrrelser1,,2. Årsagen til manglen på fænotype i transgene gnaveremodeller kan være baseret på yderst effektive kompenserende mekanismer3. I tilfælde af dystoni, sygdommen er karakteriseret ved ufrivillige muskelsammentrækninger forårsager vride bevægelser og unormale stillinger4. Undersøgelsen af sekundære årsager (dvs. hjerneskade) af dystoniske symptomer, har bidraget til at identificere de strukturer, der er involveret i manifestationen af disse motoriske abnormiteter, såsom de basale ganglier5. Hjernescanningsundersøgelser af arvelige former for dystoni har vist funktionelle abnormiteter i næsten alle hjerneregioner, der er ansvarlige for motorisk kontrol og sensorisk integration6,7. Men, gnaver modeller er stadig behov for at uddybe forståelsen af de neurale dysfunktioner på en molekylær og storstilet netværksniveau samt for udvikling af terapeutiske muligheder. Det er her farmakologiske musemodeller giver mulighed for at kopiere de kliniske og patologiske træk ved en sygdom på en mere præcis måde.
Hurtig debut dystoni-parkinsonisme (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) er en af de arvelige former for dystoni. Det er forårsaget af tab af funktion mutationer i ATP1α3 genet, som koder for α3-underenhed af Na+/ K+-ATPase8. Endvidere er det anerkendt, at genmutation luftfartsselskaber kan være fri for symptomer i årevis, før akut udvikle vedvarende generaliseret dystoni og parkinsonisme efter udsættelse for en stressende begivenhed. Faktisk er penespring af DYT/PARK-ATP1A3 ufuldstændige og stressende begivenheder, der fungerer som en udløser spænder fra fysisk overanertion og ekstreme temperaturer til overforbrug af alkohol og infektioner9,10. For at studere DYT/PARK-ATP1A3 og finde potentielle terapeutiske indgreb, er det blevet forsøgt adskillige gange at efterligne den stressafhængige sygdomsudvikling i gnavere modeller. Men bortset fra den ene eksisterende genetiske DYT/PARK-ATP1A3 mus model, hvor forbigående unormale og kramper-lignende bevægelser blev induceret af hypotermi, alle offentliggjorte genetiske musemodeller for DYT /PARK-ATP1A3 har undladt at producere dystoniskesymptomer 1,11,12. Calderon et al. har tidligere vist, at blokering af α3-underenhed bilateralt i de basale ganglier og lillehjernen via hjerteglycosid ouabain i vilde type mus resulterer i mild gangforstyrrelser13. Den yderligere eksponering for elektriske fodstød i et varmt miljø førte til en dystonisk og bradykinetisk fænotype, hvilket viser, at kronisk og målrettet perfusion af ouabain efterfulgt af stress med succes efterligner DYT/PARK-ATP1A3 fænotype.
Men, udsætter dyr for elektriske fodstød i et varmt miljø på 38-40 °C over en to timers periode inducerer smerte og angst hos dyr, som repræsenterer confounding faktorer, især for vurdering af ændringer i katekolamin system i forbindelse med udviklingen af dystoni. Således vi heri beskrive en anden form for stress paradigme med høj translationel værdi, som vedrører tilbage til det faktum, at mild til moderat motion er blevet beskrevet som udløser i DYT /PARK-ATP1A3 patienter9. Desuden gentagne motion er en velkendt udløser for fokal dystoni14. Mus blev gentagne gange udsat for udfordrende motoriske opgaver, der bestod af tre nedstigninger af en træstang (“pole test”) og tre kører på en Rotarod apparat (“Rotarod performance test”). Placeringen af dyr på toppen af en 50 cm træstang blev brugt til at tvinge dyrene til at stige ned, Rotarod apparatet blev ansat til at underkaste mus til tvungen aktivitet ved at placere dem på en roterende stang.
Karakteriseringen af motorfænotypen af en musemodel for dystoni er særlig udfordrende på grund af manglen på foruddefinerede tests og scorer. Der er imidlertid gentagne gange i de seneste år blevet anvendt en variation af en vurdering af motorisk invaliditet for at vurdere sværhedsgraden og fordelingen af dystonilignende bevægelser hos gnavere13,15,16. Vi heri præsentere en modificeret version af dystoni rating skala, som viste sig at være effektiv til at vurdere dystoni-lignende fænotype af dyr, når observeret over en periode på fire minutter. Som en anden metode til vurdering af dystoni-lignende bevægelser præsenterer vi et nyudviklet pointsystem til vurdering af unormale bevægelser under en haleaffjedringstest. Det giver mulighed for vurdering af hyppigheden og varigheden af dystoni-lignende bevægelser og stillinger af de forreste lemmer, bagben samt trunk.
Denne DYT/PARK-ATP1A3 farmakologiske musemodel giver mulighed for en detaljeret analyse af intracerebral strukturelle og neurokemiske ændringer, der udelukkende induceres ved hæmning af natrium-kaliumionpumpen i de basale ganglier og cerebellum samt ændringer i forbindelse med stresseksponering. I tilfælde af mus kan maksimalt to osmotiske pumper implanteres subkutende. Vi heri præsentere en metode beskriver kronisk lægemiddellevering til flere hjernestrukturer ved at gennemføre en dobbelt kanyle forbundet til en bifurcation adapter ud over en enkelt kanyle. Denne metode kan bruges til enhver anvendelse, der kræver flere hjernestrukturer, der skal perfunderes samtidigt og kronisk.
Vi præsenterer en musemodel af en sjælden bevægelsesforstyrrelse, hvor patienter udvikler permanente symptomer efter udsættelse for stress. Denne formodede gen-miljømæssige interaktion er stadig ikke godt forstået, men kan repræsentere en af de vigtigste pathomechanisms i DYT/PARK-ATP1A3 udvikling. Forskellige metoder til at udsætte mus for stress er blevet offentliggjort i fortiden og omfatter elektriske fod stød, fastholdende, koldt eller varmt miljø og udsættelse for forskellige lugte11,,12,13. I et forsøg på at udsætte mus for en mild stressfaktor med translationel værdi beskriver vi heri musenes gentagne underkastelse af udfordrende motoriske opgaver. Til poletesten afslørede ouabain-perfunderede dyr ufrivillig hyperextension af forlemme og bagben. Disse bevægelser var meget lig de dystoni-lignende bevægelser observeret under 4-min videooptagelse af dyrene samt hale suspension test. Anvendelsen af mild stress i form af udfordrende motoriske opgaver kan vise sig nyttige i andre musemodeller, der viser motoriske symptomer eller neurodegeneration, hvor gen-miljømæssige interaktioner massivt påvirker graden af sygdomsprogression.
Der er en generel mangel på foruddefinerede adfærdsmæssige opgaver samt rating skalaer til at klassificere unormale bevægelser og stillinger i mus. De fleste af de tilgængelige motoriske opgaver afslører uspecifik abnormiteter, såsom hindlimb clasping, som er et velkendt fænomen i mange musemodeller af bevægelsesforstyrrelser med neurodegeneration18,19. For den korrekte karakterisering af en fænotype, er det dog nødvendigt at analysere, om musen model opsummerer de fremtrædende funktioner i sygdommen. Heri præsenterer vi den modificerede version af en dystoni rating skala, der tidligere blev brugt til vurdering af motoriske handicap i dystoni musmodeller 15,16. Vi udviklede desuden et observatørbaseret pointsystem til haleaffjedringstesten, som blev etableret på samme måde som de kliniske klassificeringsskalaer for human dystoni. Begge karakterskalaer viser en signifikant højere score i ouabain-perfunderes, stressede mus sammenlignet med ouabain-perfunderes, ikke-stressede dyr samt køretøjsperfunderede dyr. Ulemperne ved ethvert observatørbaseret pointsystem er den nødvendige uddannelse af raters for at sikre en konsekvent scoring og for at reducere observatørvariationen samt faren for en mulig skævhed i rateren, hvis ikke helt forblændet til den analyserede gruppe. Observatørbaserede scoringssystemer udgør dog stadig en lettilgængelig metode til at karakterisere en fænotype og kan tilpasses musemodellen analyseres, som det gøres i dette projekt til vurdering af dystonilignende bevægelser. For at sikre en ensartet score blandt forskellige bedømmere bør træningsvideoer gøres tilgængelige. For at reducere eventuelle bias, anbefales det, at forskellige raters score de samme videoklip, og at de enkelte scores er i gennemsnit. Begge scoringssystemer, der er nævnt i dette arbejde, registrerer tilstedeværelsen af dystonilignende bevægelser hos dyr. Karakterskalaerne kan tilpasses efter de specifikke krav i et projekt, som tidligere er udført af Ip et al., hvor der udelukkende blev scoret bagben for dystonilignende bevægelser i en musemodel for dystoni 1 (DYT-TOR1A)20. Ratingskalaerne kan suppleres af andre tidligere offentliggjorte scoringssystemer, der for eksempel vurderer graden af bradykinesi hos gnavere som udført med den bevægelseshandicapscore, som Calderon et al.13 .
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af forbundsministeriet for uddannelse og forskning (BMBF DysTract til C.W.I.) og af Det Tværfaglige Center for Klinisk Forskning (IZKF) ved Universitetet i Würzburg (Z2-CSP3 til L.R.). Forfatterne takker Louisa Frieß, Keali Röhm, Veronika Senger og Heike Menzel og for deres tekniske bistand samt Helga Brünner for dyreplejen.
0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm long with a thread of 1mm O.D. |
Bulldog Clamps | Agntho's | 13-320-035 | straight, 3.5 cm |
Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
Cannula and Minipump Holder | Stoelting | 51636 | designed to hold 3.4 mm cannula heads |
Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | custom made |
Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm |
Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fine forceps |
eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting | 56109M | |
Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | dental cement, liquid |
Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | dental cement, red powder |
Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adaptor for mice for a traditional U-frame |
needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
Octenisept | Schülke | 118211 | |
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm |
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, custom length 3.0 mm |
Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | CAUTION: toxic |
Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
Rectal Thermal Probe | Stoelting | 50304 | |
Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting | 53800M | |
RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
screw driver set | Agntho's | 30090-6 | |
Stainless Steel Burrs | Agntho's | HM71009 | 0.9 mm Ø burr |
Stainless Steel Burrs | Agntho's | HM71014 | 1.4 mm Ø burr |
StereoDrive | Neurostar | software | |
Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | custom made by Neurostar | |
Stereotaxic robot | Neurostar | ||
suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |