Exploration de la structure des tissus adipeux par compensation du méthylsalicylate et imagerie 3D

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode simple, peu coûteuse et rapide de compensation pour résoudre la structure 3D de la souris et du tissu adipeux blanc humain en utilisant une combinaison de marqueurs pour visualiser la vascularisation, les noyaux, les cellules immunitaires, les neurones, et les protéines de couche de lipide-goutte par imagerie fluorescente.

Résumé

L’obésité est un problème majeur de santé publique dans le monde entier qui augmente le risque de développer des maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2 et des maladies du foie. L’obésité se caractérise par une augmentation de la masse de tissu adipeux (AT) due à l’hyperplasie d’adipocyte et/ou à l’hypertrophie, menant au remodelage profond de sa structure tridimensionnelle. En effet, la capacité maximale d’AT à se développer pendant l’obésité est essentielle au développement des pathologies associées à l’obésité. Cette expansion AT est un mécanisme homéostatique important pour permettre l’adaptation à un excès d’apport énergétique et pour éviter les retombées délétères lipidiques à d’autres organes métaboliques, tels que les muscles et le foie. Par conséquent, la compréhension du remodelage structurel qui conduit à l’échec de l’expansion AT est une question fondamentale avec une applicabilité clinique élevée. Dans cet article, nous décrivons une méthode de compensation simple et rapide qui est couramment utilisée dans notre laboratoire pour explorer la morphologie de la souris et du tissu adipeux blanc humain par imagerie fluorescente. Cette méthode de compensation AT optimisée est facilement réalisée dans n’importe quel laboratoire standard équipé d’une hotte chimique, d’un shaker orbital à température contrôlée et d’un microscope fluorescent. De plus, les composés chimiques utilisés sont facilement disponibles. Fait important, cette méthode permet de résoudre la structure 3D AT en tachant divers marqueurs pour visualiser spécifiquement les adipocytes, les réseaux neuronaux et vasculaires, et la distribution innée et adaptative des cellules immunitaires.

Introduction

L’obésité se caractérise par une augmentation de la masse tissulaire adipeuse et est devenue un problème majeur de santé publique dans le monde entier, étant donné que les personnes souffrant d’obésité ont un risque accru de développer des maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2, les maladies du foie et certains cancers.

Une fonction physiologique fondamentale du tissu adipeux est de moduler l’homéostasie du glucose entier du corps et des lipides^1,2. Pendant la période d’alimentation, les adipocytes (c.-à-d. les principales cellules du tissu adipeux) stockent l’excès de glu....

Protocole

Ce protocole a été testé et est validé pour tous les dépôts de tissus adipeux blancs et de souris. Les tissus adipeux humains et murins ont été recueillis en conséquence aux lois européennes et approuvés par les comités d’éthique Français et suédois.

1. Fixation de la souris et du tissu adipeux blanc humain

1. Immerger la souris récoltée ou les tissus adipeux blancs humains dans au moins 10 ml de PBS contenant 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans un tube en plastique de 15 mL.
2. Agiter le tube en plastique à température ambiante sur une plaque de roulement pendant 1 h.
3. Laisser le tube en plastique à 4 °C sur une plaque....

Résultats

En utilisant la procédure décrite ici et résumée à la figure 1, nous avons été en mesure de tacher et optiquement clair l’homme et la souris blanc tissu adipeux tel que présenté à la figure 2A et figure 2B, respectivement. Le tissu effacé a été transféré à la chambre d’imagerie métallique pour effectuer l’imagerie confocale (figure 3A). La compensation a considérablement amélioré la profondeur des image.......

Discussion

Les modifications qui se produisent dans le tissu adipeux au cours de la progression pathologique, comme celle de l’obésité, est fondamentale pour la compréhension des mécanismes derrière la pathologie. Des études pionnières qui ont révélé de tels mécanismes dans les tissus adipeux ont été basées sur des approches globales telles que la protéomique tissulaire adipeuse entière²¹, cytométrie de flux^22,23, et transcriptomics^.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microtubes de 1,5 mL	Tubes Eppendorff - Dutscher	33528
Tubes en plastique de 15 mL	Tubes Falcon - Dutscher	352096
18 mm lamelle ronde en verre	Mariendfeld	0117580
Flacon en verre de 20 mL	Wheaton	986546
anticorps conjugué anti-souris alexa647	Jackson ImmunoResearch	715-605-150	Dilution : 1/100
anticorps conjugué anti-rabbit-alexa647	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Dilution : 1/100
BSA	Sigma-aldrich	A6003
CD301-PE	Biolegend	BLE145703	Dilution : 1/100
Anticorps CD31	AbCam	ab215912	Dilution : 1/50
Logiciel d’analyse 3D commercial - IMARIS	Oxford instrument		avec module
Cell Microscope confocal - Nikon A1R	Nikon
Dapi	ThermoFisher	D1306	Stock Concentration : 5 mg/mL ; dilution 1/1000
Déoxycholate	Sigma-aldrich	D6750
DMSO	Sigma-aldrich	D8418
Glut4	anticorps Santa Cruz	sc-53566	Dilution : 1/50
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
Lectin-DyLight649	Vector Lab	DL-1178-1	Concentration de stock : 2 µ ; g/µ ; L; Injection IV : 50 & micro ; L/souris
Chambre d’imagerie métallique équipée d’un fond en verre - Chambre AttoFluor	Thermofisher	A7816
Salicylate de méthyle	Sigma-aldrich	M6752
Anticorps contre la périlpine	Progen	651156	Dilution : 1/50
Phalloidin-alexa488	ThermoFisher	A12379	Dilution : 1/100
Anticorps TCR-&beta ;-PB	Biolegend	BLE109225	Dilution : 1/100
TH anticorps	AbCam	ab112	Dilution : 1/50
Triton X100	Sigma-aldrich	X100
Tween-20	Sigma-aldrich	P416

anticorps