Genetisk variantdeteksjon i CALR-genet ved hjelp av høyoppløselig smelteanalyse
Summary
Høyoppløselig smelteanalyse (HRM) er en sensitiv og rask løsning for genetisk variantdeteksjon. Det avhenger av sekvensforskjeller som resulterer i at heteroduplexer endrer formen på smeltekurven. Ved å kombinere HRM og agarose gelelektroforese, kan forskjellige typer genetiske varianter som indels identifiseres.
Abstract
Høyoppløselig smelteanalyse (HRM) er en kraftig metode for genotyping og genetisk variasjonsskanning. De fleste HRM-applikasjoner er avhengige av mettende DNA-fargestoffer som oppdager sekvensforskjeller, og heteroduplekser som endrer formen på smeltekurven. Utmerket instrumentoppløsning og spesiell dataanalyseprogramvare er nødvendig for å identifisere de små smeltekurveforskjellene som identifiserer en variant eller genotype. Ulike typer genetiske varianter med forskjellige frekvenser kan observeres i genet som er spesifikt for pasienter med en bestemt sykdom, spesielt kreft og i CALR-genet hos pasienter med Philadelphia-kromosom-negative myeloproliferative neoplasmer. Enkelt nukleotidendringer, innsettinger og/eller slettinger (indels) i genet av interesse kan oppdages av HRM-analysen. Identifiseringen av ulike typer genetiske varianter er for det meste basert på kontrollene som brukes i qPCR HRM-analysen. Men etter hvert som produktlengden øker, blir forskjellen mellom wild-type og heterozygote kurver mindre, og typen genetisk variant er vanskeligere å bestemme. Derfor, hvor indels er den utbredte genetiske varianten som forventes i genet av interesse, kan en ekstra metode som agarose gel elektroforese brukes til avklaring av HRM-resultatet. I noen tilfeller må et inkonklusivt resultat kontrolleres/diagnostiseres på nytt ved standard Sanger-sekvensering. I denne retrospektive studien brukte vi metoden på JAK2 V617F-negative pasienter med MPN.
Introduction
Somatiske genetiske varianter i calreticulin-genet (CALR) ble anerkjent i 2013 hos pasienter med myeloproliferative neoplasmer (MPN) som essensiell trombocytemi og primær myelofibrose1,2. Siden da har mer enn 50 genetiske varianter i CALR-genet blitt oppdaget, og induserer en +1 (−1 +2) frameshift3. De to hyppigste CALR genetiske varianter er en 52 bp sletting (NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs *46)), også kalt type 1 mutasjon, og en 5 bp innsetting (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, s.(Lys385Asnfs*47)), også kalt type 2 mutasjon. Disse to genetiske variantene representerer 80% av alle CALR genetiske varianter. De andre har blitt klassifisert som type 1-lignende eller type 2-lignende ved hjelp av algoritmer basert på bevaring av en α helix nær wild type CALR4. Her presenterer vi en av de svært følsomme og raske metodene for CALR genetisk variantdeteksjon, den høyoppløselige smelteanalysemetoden (HRM). Denne metoden muliggjør rask deteksjon av type 1 og type 2 genetiske varianter, som representerer de fleste CALR-mutasjoner 5. HRM ble introdusert i kombinasjon med sanntid »polymerasekjedereaksjon« (qPCR) i 1997 som et verktøy for å oppdage mutasjonen i faktor V Leiden6. Sammenlignet med Sanger-sekvensering som representerer den gylne standardteknikken, er HRM en mer følsom og mindre spesifikk metode5. HRM-metoden er en god screeningmetode som muliggjør en rask analyse av et stort antall prøver med stor nytte-kostnadsgevinst5. Det er en enkel PCR-metode utført i nærvær av fluorescerende fargestoff og krever ikke spesifikke ferdigheter. En annen fordel er at selve prosedyren ikke skader eller ødelegger den analyserte prøven som gjør at vi kan gjenbruke prøven for elektroforese eller Sanger-sekvensering etter HRM-prosedyren7. Den eneste ulempen er at det noen ganger er vanskelig å tolke resultatene. I tillegg oppdager HRM ikke den nøyaktige mutasjonen hos pasienter med mutasjoner av ikke-type 1 eller type 28. Hos disse pasientene skal Sanger-sekvensering utføres (figur 1).
HRM er basert på forsterkning av den spesifikke DNA-regionen i nærvær av mettende DNA fluorescerende fargestoff, som er innlemmet i dobbeltstrenget DNA (dsDNA). Det fluorescerende fargestoffet avgir lys når det er innlemmet i dsDNA. Etter en progressiv temperaturøkning bryter dsDNA ned i enkeltstrenget DNA, som kan oppdages på smeltekurven som en plutselig reduksjon i fluorescensintensiteten. Formen på smeltekurven avhenger av DNA-sekvensen som brukes til å oppdage mutasjonen. Smeltekurver av prøver sammenlignes med smeltekurver av kjente mutasjoner eller villtype CALR. Distinkte smeltekurver representerer en annen mutasjon som ikke er type 1 eller type 29.
Algoritmen for den somatiske genetiske variantdeteksjonen i CALR-genet av HRM, agarose gelelektroforese og sekvenseringsmetode (figur 1) ble brukt og validert i den retrospektive studien publisert før10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Høyoppløselig smelting av DNA er en enkel løsning for genotyping og genetisk variantskanning14. Det avhenger av sekvensforskjeller som resulterer i heteroduplexer som endrer formen på smeltekurven. Ulike typer genetiske varianter med forskjellige frekvenser kan observeres i genet som er spesifikt for en bestemt gruppe pasienter med kreft1,2,15,16,<sup clas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke alle akademiske eksperter og ansatte ved Det spesialiserte hematologilaboratoriet, Institutt for hematologi, Institutt for indremedisin, Universitetssykehuset Ljubljana.
Materials
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
References
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) – More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. . QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. . High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. . High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D. Agarose Gel Electrophoresis. Current Protocols in Immunology. 2, (1992).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
