कैप-डिपेंडेंट ट्रांसल काइनेटिक्स के विश्लेषण के लिए इन विट्रो सिंगल-अणु इमेजिंग परख
Summary
व्यक्तिगत अनुवाद घटनाओं पर नज़र रखने कैप-निर्भर अनुवाद तंत्र के उच्च संकल्प गतिज अध्ययन के लिए अनुमति देता है। यहां हम फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी और एपिटोप-टैग नवजात पेप्टाइड्स के बीच इमेजिंग इंटरैक्शन के आधार पर एक इन विट्रो एकल-अणु परख प्रदर्शित करते हैं। यह विधि सक्रिय इन विट्रो कैप-डिपेंडल अनुवाद के दौरान दीक्षा और पेप्टाइड विस्तार गतिज के एकल अणु लक्षण वर्णन को सक्षम बनाती है।
Abstract
कैप-डिपेंडेंट प्रोटीन संश्लेषण यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रमुख अनुवाद मार्ग है। जबकि विभिन्न जैव रासायनिक और आनुवंशिक दृष्टिकोणों ने कैप-निर्भर अनुवाद और इसके विनियमन के व्यापक अध्ययन की अनुमति दी है, इस अनुवाद मार्ग के उच्च संकल्प गतिज लक्षण वर्णन अभी भी कमी है। हाल ही में, हमने एकल-अणु संकल्प के साथ कैप-निर्भर अनुवाद काइनेटिक्स को मापने के लिए एक इन विट्रो परख विकसित की। परख फ्लोरोसेंटी लेबल एंटीबॉडी पर आधारित है जो नवजात एपिटोप-टैग किए गए पॉलीपेप्टाइड के लिए बाध्यकारी है। नवजात पेप्टाइड-राइबोसोम-एमआरएनए परिसरों से एंटीबॉडी के बाध्यकारी और वियोजन को इमेजिंग करके, व्यक्तिगत mRNAs पर अनुवाद प्रगति को ट्रैक किया जा सकता है। यहां, हम इस परख को स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसमें एमआरएनए और पेग्यालेटेड स्लाइड तैयारी, अनुवाद की वास्तविक समय इमेजिंग और एकल अणु प्रक्षेप पथ का विश्लेषण शामिल है। यह परख व्यक्तिगत टोपी पर निर्भर अनुवाद घटनाओं की ट्रैकिंग में सक्षम बनाता है और इस तरह के दीक्षा और विस्तार दरों के रूप में प्रमुख अनुवाद काइनेटिक्स, हल करता है । परख व्यापक रूप से अलग अनुवाद प्रणालियों के लिए लागू किया जा सकता है और मोटे तौर पर टोपी पर निर्भर अनुवाद गतिज और अनुवाद नियंत्रण तंत्र के विट्रो अध्ययन में लाभ होना चाहिए ।
Introduction
यूकेरियोटिक सिस्टम में अनुवाद मुख्य रूप से 7-मिथाइलगुआनोसिन (एम 7 जी) कैप-निर्भररास्ते1के माध्यम से होता है। अध्ययनों से पता चलता है कि यूकेरियोटिक अनुवाद का दीक्षा कदम दर-सीमित हैऔर विनियमन2,3,4के लिए एक आम लक्ष्य है। कैप-निर्भर अनुवाद के तंत्र का आनुवंशिक5,जैव रासायनिक6,7,8,संरचनात्मक9,और जीनोमिक10 थोक दृष्टिकोणों का उपयोग करके बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। यद्यपि इन तरीकों ने विविध तंत्रों की पहचान की है जो कैप-निर्भर दीक्षा को विनियमित करते हैं, उनका संकल्प उन्हें विषम और अतुलित दीक्षा घटनाओं से संकेतों के औसत के कलाकारों की टुकड़ी तक सीमित करता है। हाल ही में, वीवो अनुवाद घटनाओं में व्यक्तिगत तरीकों से कल्पना की गई है जो फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी को नवजात पॉलीपेप्टिड्स11, 12,13,14पर एपिटोप करने के लिए बाध्यकारी उपाय करते हैं। हालांकि, ये नए दृष्टिकोण व्यक्तिगत दीक्षा घटनाओं को हल करने की क्षमता में भी सीमित हैं क्योंकि कई फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी को एक प्रारंभिक पेप्टाइड को बांधना चाहिए ताकि एकल अनुवाद घटनाओं को उच्च इंट्रासेलुलर फ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि से हल किया जा सके। कई जैविक बातचीत में, हल किए गए व्यक्तिगत गतिज घटनाओं ने जटिल मल्टीस्टेप और दोहराव वाली जैविक प्रक्रियाओं को समझने में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है जो आणविक स्तर पर सिंक्रोनाइज़ करना संभव नहीं है। नए तरीके जो व्यक्तिगत अनुवाद घटनाओं की गतिशीलता को ट्रैक कर सकते हैं, कैप-निर्भर दीक्षा और विनियमन की बेहतर समझ के लिए आवश्यक हैं।
हमने हाल ही में एक इन विट्रो परख विकसित की है जो एकल-अणु संकल्प15के साथ कैप-निर्भर दीक्षा काइनेटिक्स को मापता है। इस दीक्षा मार्ग 3,16में शामिल ज्ञात और अज्ञात प्रोटीन कारकों की बड़ी संख्या को ध्यान में रखतेहुए,एकल अणु परख को मौजूदा इन विट्रो सेल-मुक्त अनुवाद प्रणालियों के साथ संगत करने के लिए विकसित किया गया था ताकि सेलुलरकारकों के संरक्षण और मजबूत अनुवाद गतिविधि17, 18,19,20, 21,22, 23,24,25के संरक्षण से लाभ हो सके । इसके अलावा, सेल-मुक्त अनुवाद प्रणालियों का उपयोग एकल-अणु टिप्पणियों और पिछले थोक परिणामों के बीच अधिक संगत तुलना की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण कैप-निर्भर दीक्षा के मौजूदा यंत्रवादी ढांचे में नए एकल-अणु गतिज अंतर्दृष्टि का सीधा-आगे एकीकरण प्रदान करता है। एकल अणु परख स्थापित करने के लिए, पारंपरिक सेल-मुक्त अनुवाद प्रणाली को तीन तरीकों से संशोधित किया जाता है: एक रिपोर्टर एमआरएनए के खुले रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) की शुरुआत में एक एपिटोप-एन्कोडिंग अनुक्रम डाला जाता है; रिपोर्टर एमआरएनए का 3 ‘अंत एकल-अणु का पता लगाने की सतह पर एमआरएनए एंड-टेदरिंग की सुविधा के लिए बायोटिनिलेटेड है; और फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले एंटीबॉडी को अनुवाद निकालने के लिए पूरक किया जाता है। इन संशोधनों के लिए केवल बुनियादी आणविक जीव विज्ञान तकनीकों और आमतौर पर उपलब्ध अभिकर्षकों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, ये संशोधन और एकल-अणु इमेजिंग स्थितियां थोक सेल-मुक्त अनुवाद प्रतिक्रियाओं15के अनुवाद काइनेटिक्स को संरक्षित करती हैं।
इस परख में(चित्रा 1),5′-अंत छाया हुआ और 3′-अंत बायोटिनेलेटेड रिपोर्टर एमआरएनए को प्रवाह कक्ष में एक स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित डिटेक्शन सतह पर स्थिर किया जाता है। प्रवाह कक्ष तो फ्लोरोसेंटी लेबल एंटीबॉडी के साथ पूरक एक सेल मुक्त अनुवाद मिश्रण से भर जाता है । एमआरएनए अनुवाद के बाद एपिटोप अनुक्रम26, 27के लगभग 30-40 कोडन डाउनस्ट्रीम के लिए हुआहै,एपिटोप राइबोसोम निकास सुरंग से उभरता है और फ्लोरोसेंटली-लेबल एंटीबॉडी के साथ बातचीत करने के लिए सुलभ हो जाता है। यह बातचीत तेजी से होती है और एकल-अणु फ्लोरेसेंस इमेजिंग तकनीकों द्वारा इसका पता लगाने से सक्रिय सेल-मुक्त अनुवाद के दौरान एकल-अणु संकल्प के साथ अनुवाद काइनेटिक्स की ट्रैकिंग में सक्षम होता है। इस परख मोटे तौर पर टोपी पर निर्भर अनुवाद गतिज और उसके विनियमन के विट्रो अध्ययन में लाभ होना चाहिए, विशेष रूप से विट्रो परख में एक काम थोक के साथ प्रणालियों के लिए ।
इस एकल अणु परख की स्थापना के लिए एक शर्त एक काम थोक सेल मुक्त अनुवाद परख है, जो अनुवाद निकालने का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है कि या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है या पहले वर्णित तरीकों के बाद तैयार28। यूकेरियोटिक अनुवाद अर्क को विभिन्न कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें फंगल, स्तनधारी और पौधे28शामिल हैं। इमेजिंग के लिए, इस परख के लिए एक TIRF माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है जो ट्यूनेबल लेजर तीव्रता और घटना कोण, एक मोटराइज्ड नमूना चरण, एक मोटराइज्ड फ्लूइडिक्स सिस्टम और नमूना तापमान नियंत्रण उपकरण से लैस है। ऐसी आवश्यकताएं आधुनिक इन विट्रो एकल-अणु टीआईआरएफ प्रयोगों के लिए सामान्य हैं और इन्हें अलग ढंग से हासिल किया जा सकता है । यहां प्रस्तुत प्रयोग एक उद्देश्य प्रकार TIRF प्रणाली का उपयोग करता है जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोप, सॉफ्टवेयर और सहायक उपकरणों से बना है जो सभी सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
विशिष्ट इन विट्रो टीआईआरएफ एकल-अणु प्रयोगों की तुलना में, यहां वर्णित परख के साथ एकल-अणु इमेजिंग सेल एक्सट्रैक्ट के उपयोग और फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी की उच्च एकाग्रता के कारण अतिरिक्त रूप से जट?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [R01GM121847] द्वारा समर्थित किया गया था; मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर (MSKCC) समर्थन अनुदान/कोर ग्रांट (P30 CA008748); और एमएसकेसीसी कार्यात्मक जीनोमिक्स पहल।
Materials
| 100X oil objective, N.A. 1.49 | Olympus | UAPON 100XOTIRF | |
| Acryamide/bis (40%, 19:1) | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Alkaline liquid detergent | Decon | 5332 | |
| Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) | UCT Specialties, LLC | A0700 | |
| Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD | Andor | DU-897U-CSO-#BV | |
| Andor Solis software | Andor | For controlling the Andor EMCCD | |
| Band-pass filter | Chroma | 532/640/25 | |
| Band-pass filter | Chroma | NF03-405/488/532/635E-25 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio Inc | Biotin-PEG-SVA | |
| Coenzyme A free acid | Prolume | 309-250 | |
| Coolterm software | For controlling the syringe pump | ||
| Desktop computer | Dell | For controlling the microscope, camera, stage, and pump. | |
| Dichroic mirror | Semrock | R405/488/532/635 | |
| Direct-zol RNA microprep 50RNX | Fisher Scientific | NC1139450 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Epoxy | Devcon | 14250 | |
| Firefly luciferin D-Luciferin free acid | Prolume | 306-250 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP1185500 | |
| Hydrogen perioxide | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | |
| Immersion oil | Olympus | Z-81226A | Low auto-fluorescence |
| Luciferase Assay System | Promega | E1500 | |
| MEGASCRIPT T7 Transcription Kit | Thermo fisher | AM1334 | |
| Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope slide | Thermo Scientific | 3048 | |
| Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 | Sigma-Aldrich | A9594 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio Inc | mPEG-SVA-5000 | |
| MS(PEG)4 | Thermo Scientific | 22341 | |
| NaCl (5M) | Thermo Scientific | AM9760G | |
| No 1.5 microscope Cover glass | Fisherband | 12-544-C | |
| Olympus Laser, 532nm 100mM | Olympus digital Laser system | CMR-LAS 532nm 100mW | |
| Olympus TirfCtrl software | Olympus | For controlling the laser intensity and incident angle | |
| Optical table | TMC vibration control | 63-563 | With vibration isolation |
| Phenol chloroform isoamyl alcohol mix | Sigma-Aldrich | 77617-100ml | |
| Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit | Thermo Scientific | 20160 | |
| Potassium hydroxide pellets | Sigma-Aldrich | P1767-500G | |
| Prior motorized XY translation stage | Prior | PS3J100 | |
| Prior PriorTest software | Prior | For controlling the Prior motorized stage | |
| Recombinant RNasin RNase Inhibitor | Promega | N2515 | |
| Stage top Incubator | In vivo scientific (world precision Instruments) | 98710-1 | With a custom built acrylic cage |
| Staining jar | Fisher Scientific | 08-817 | |
| Streptavidin | Thermo Scientific | 43-4301 | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300212 | |
| SYBR green II | Fisher Scientific | S7564 | |
| Syringe | Hamilton | 1725RN | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | 55-3333 | |
| Tris (1M), pH = 7.0 | Thermo Scientific | AM9850G | |
| Ultrasonic Bath | Branson | CPX1800H | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Vaccinia Capping system | New England Biolabs | M2080S | |
| Zymo-Spin IC Columns | Zymo Research | C1004 |
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