오스트레일리아 싱크로트론의 직렬 결정학 측정을 위한 지질 주입 프로토콜
Summary
이 프로토콜의 목표는 최근 호주 싱크로트론에서 의뢰한 고점성 인젝터 인Lipidico에서 데이터 수집을 위한 직렬 결정예학 샘플을 준비하는 방법을 시연하는 것입니다.
Abstract
호주 싱크로트론에서 직렬 결정학 측정을 위한 시설이 개발되었습니다. 이 시설은 실온에서 많은 수의 작은 결정을 측정하기 위해 대용량 분자 결정학 (MX2) 빔 라인의 일환으로 고점성 인젝터 인Lipidico를 통합합니다. 이 기술의 목표는 크리스탈을 유리 주사기로 재배/전송하여 직렬 결정학 데이터 수집을 위한 인젝터에 직접 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 이 인젝터의 장점은 스트림의 중단없이 유량의 변화에 신속하게 대응하는 기능을 포함한다. 이 높은 점도 인젝터 (HVI)에 대한 몇 가지 제한은 허용 된 샘플 점도에 대한 제한을 포함하는 존재 >10 Pa.s. 스트림 안정성은 샘플의 특정 특성에 따라 문제가 될 수도 있습니다. 샘플을 설정하고 호주 싱크로트론에서 직렬 결정학 측정을 위한 인젝터를 작동하는 방법에 대한 자세한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 이 방법은 리소지메 결정의 높은 점성 매체(실리콘 그리스)로의 전송을 포함한 시료의 제조를 시연하고, MX2에서 데이터 수집을 위한 인젝터의 작동을 보여 준다.
Introduction
직렬 결정학(SX)은 X선 자유 전자 레이저(XFELs)1,2,3,4의맥락에서 처음에 개발된 기술이다. 고정 대상 접근법은 SX5,6,7,전형적으로 사용될 수 있지만 인젝터 시스템은 연속 스트림에서 X선 빔에 크리스탈을 전달하기 위해 사용됩니다. 많은 수의 결정으로부터의 데이터를 결합하기 때문에 SX는 실험 중에 모든 결정 정렬의 필요성을 피하고 실온8,9에서데이터를 수집할 수 있게 한다. 적합한 인젝터의 도움으로, 결정은 X선 상호작용 영역으로 하나씩 스트리밍되고 그 결과 회절 데이터는 영역 검출기9,10에서수집된다. 현재까지 SX는 종래의 결정학을 사용하여 측정하기에는 너무 작은 결정을 포함하여1,11,12,13의 다수의 단백질 구조를 해결하는 데 성공했습니다. 또한 XFEL의 펨토초 펄스 지속 시간을 활용하여 시간 해결 된 분자 역학에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다. 광학 레이저 소스와 펌프 프로브 반응을 시공함으로써, 광시스템 II14,15,광활성 황색 단백질16,17,사이토크롬 C 산화제 18, 박테리오호도프신(19,20,21)에서심층적인 연구가 수행되었다. 이러한 연구는 시간 해결된 생물학적 과정을 이해하기 위한 직렬 결정촬영의 중요한 잠재력을 보여주는 빛 활성화 에 따라 발생하는 전자 전달 역학을 조사했습니다.
직렬 결정학의 개발은 또한 싱크로트론 소스9,12,20,22,23,24에서점점 더 널리 퍼지고있다. Synchrotron 기반 SX를 사용하면 적절한 인젝터 시스템을 사용하여 실온에서 많은 수의 개별 결정을 효율적으로 측정할 수 있습니다. 이 방법은 더 작은 결정에 적합하므로 데이터를 수집하기 위해 빠른 프레임 속도 검출기를 요구하는 것 외에도 마이크로 집중 빔도 필요합니다. 기존의 결정예촬영과 비교하여, SX는 X선 빔에 개별 결정의 장착 및 정렬을 포함하지 않습니다. 다수의 개별 결정으로부터의 데이터가 병합되기 때문에, 각 결정에 의해 수신된 방사선 량은 종래의 결정예예촬영에 비해 실질적으로 감소될 수 있다. 싱크로트론 SX는 또한 밀리초 정권에 이르기까지 시간 해결 된 반응의 연구에 적용 될 수 있으며, 충분히 높은 프레임 속도를 가진 검출기가 사용할 수 있는 경우 (예를 들어, 100 Hz 이상). 몇몇 직렬 결정학 실험은 XFEL 근원에서 처음 개발된 인젝터를 사용하여 싱크로트론에서 수행되었습니다20,22,23. 인젝터의 두 가지 가장 일반적인 유형은 가스 동적 가상 노즐 (GDVN)25 및 고점성 인젝터 (HVI)9,24,26,27,28이다. GDVN은 낮은 점도, 액체 샘플을 주입하는 데 이상적이지만 안정적인 스트림을 달성하기 위해 높은 유량이 필요하며, 이는 높은 시료 소비율로 이어집니다. 대조적으로, HVI는 훨씬 낮은 유량에서 안정적인 스트림의 생성을 허용하는 높은 점도 샘플에 적합하여 훨씬 낮은 샘플 소비로 이어집니다. 따라서 HVI 인젝터는 점성 담체가 바람직하다는 샘플(예: 막 단백질용 지질 계주) 및/또는 다량의 시료를 사용할 수 없는 시료의 전달을 선호합니다. SX 인젝터는 일반적으로 사용하기 가 어렵고 운영에 광범위한 교육이 필요합니다. 그들은 또한 샘플이 전문 저수지에 로드되어야하기 때문에 긴 샘플 전송 프로토콜을 포함하며, 일반적으로 샘플이 ‘죽은 부피’에서 또는 연결의 누출을 통해 손실되는 것과 관련된 고위험이 있습니다. 따라서, X선 빔에 도달하는 샘플이전에 손실을 완화하기 위해 인젝터 설계를 최적화하는 것이 바람직하다.
최근에는 아이거 16M 검출기를 사용하여 리소지메 표적을 가진 Lipidico23을 사용하여 첫 번째 SX 결과가 발표되었습니다. 이 인젝터 설계는 초기 결정화에서 인젝터로 의결정 전달에 관련된 단계수를 최소화한 다음 X선 빔에 시료를 전달하는 데 관련된 단계 수를 최소화하여 샘플 낭비를 제한합니다. 이 원고는 샘플 준비부터 동일한 결정화 용기를 사용하여 주사 공정으로 이동하고 마지막으로 데이터 수집을 통해 샘플 전송 절차를 설명하고 시연합니다. 인젝터의 작동도 설명되어 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
대체 HVI가 개발되어 싱크로트론 소스에서 SX 실험을 수행하는 데 이상적입니다. 기존 HV에 비해 두 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 기존의 결정학과 SX 를 빠르게 전환할 수 있도록 빔라인에 설치하기 쉽고, MX2의 설치 및 정렬에 불과 ~30분이 소요된다. 둘째, 결정을 성장시키는 데 사용되는 샘플 주사기는 직접 주입을 위한 저수지로서 사용될 수 있으며, 시료 전달 시 낭비를 제한할 수 있다. 샘플 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 고급 분자 이미징 (CE14010001)의 우수성호주 연구 위원회 센터에 의해 지원되었다 (ce140100011) (http://www.imagingcoe.org/). 이 연구는 ANSTO의 일부인 호주 싱크로트론의 MX2 빔라인을 사용하여 부분적으로 착수되었으며 호주 암 연구 재단 (ACRF) 검출기를 사용했습니다.
Materials
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
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