Quantification du micro-environnement de tumeur métastatique du cerveau à l’aide d’un modèle 3D à puce d’organe sur une puce, d’apprentissage automatique et de tomographie confocale
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour préparer et cultiver un micro-environnement métastatique de tumeur de barrière de cerveau de sang et puis quantifiant son état utilisant l’imagerie confocale et l’intelligence artificielle (apprentissage automatique).
Abstract
Les métastases cérébrales sont les lésions cancéreuses les plus mortelles; 10-30% de tous les cancers métastasent au cerveau, avec une survie médiane de seulement ~5-20 mois, selon le type de cancer. Pour réduire la charge tumorale métastatique du cerveau, les lacunes dans les connaissances de base et translationnelles doivent être comblées. Parmi les principaux défis, mentionnons le manque de modèles précliniques reproductibles et d’outils associés. Les modèles tridimensionnels de métastase cérébrale peuvent produire les données moléculaires et phénotypiques pertinentes utilisées pour répondre à ces besoins lorsqu’elles sont combinées à des outils d’analyse dédiés. En outre, par rapport aux modèles murins, les modèles d’organe sur puce des cellules tumorales patientes traversant la barrière hémato-encéphalique dans le microenvironnement cérébral génèrent des résultats rapidement et sont plus interprétables avec des méthodes quantitatives, donc utilisables à des tests à haut débit. Ici, nous décrivons et démontrons l’utilisation d’une nouvelle niche du cerveau du sang microfluidique 3D (μmBBN) plate-forme où de multiples éléments de la niche peuvent être cultivés pendant une période prolongée (plusieurs jours), fluorescente imaged par microscopie confocale, et les images reconstruites à l’aide d’une technique de tomographie confocale innovante; tous visaient à comprendre le développement de la micro-métastase et des changements au micro-environnement tumoral (TME) d’une manière répétable et quantitative. Nous démontrons comment fabriquer, semer, image, et analyser les cellules cancéreuses et les composants cellulaires et humoristiques TME, en utilisant cette plate-forme. En outre, nous montrons comment l’intelligence artificielle (IA) est utilisée pour identifier les différences phénotypiques intrinsèques des cellules cancéreuses qui sont capables de transiter par un modèle μmBBN et de leur attribuer un indice objectif du potentiel métastatique du cerveau. Les ensembles de données générés par cette méthode peuvent être utilisés pour répondre à des questions fondamentales et translationnelles sur les métastases, l’efficacité des stratégies thérapeutiques et le rôle du TME dans les deux.
Introduction
Les métastases cérébrales sont les lésions cancéreuses les plus mortelles; 10-30% de tous les cancers métastasent au cerveau, avec une survie médiane de seulement ~5-20 mois, selon le cancer de type1,2. Une question principale qui se pose lors de l’étude de la métastase du cancer est de savoir comment les sous-clones migrent de l’environnement humoristique de la circulation sanguine dans un organe comme le cerveau3,4. Cette question a conduit à de nombreuses variations de la migration, l’invasion, et les tests d’extravasation. Toutes ces méthodes partagent l’étape critique du comptage ou de la mesure des propriétés des cellules qui se déplacent d’un endroit à l’autre en réponse à un stimulus. La plupart des tests de migration facilement disponibles sont utilisés pour étudier la migration bidimensionnelle (2D) des cellules cancéreuses. Ceux-ci ont élucidé une richesse de connaissances; toutefois, ils ne récapitulent pas la nature tridimensionnelle du système in vivo que d’autres méthodes peuvent fournir5. Par conséquent, il est nécessaire d’étudier le micro-environnement tumoral (TME) dans les systèmes tridimensionnels (3D), mais les approches d’analyse disponibles pour les structures 3D sont limitées et souvent incohérentes.
L’un des outils 3D les plus populaires est une chambre Boyden qui se compose d’une membrane suspendue au fond d’un puits, séparant deux régions distinctes. Boyden a introduit l’essai pour étudier leucocyte chemotaxis4. Les régions inférieures peuvent être variées selon la chimie ou d’autres moyens6,,7 pour inciter les cellules de la région supérieure à migrer vers la région inférieure. L’approche la plus courante pour quantifier le nombre de cellules qui ont migré est de libérer les cellules du fond de la membrane à l’aide d’une solution tampon, de les lyser, puis de les compter en fonction de la quantité de contenu d’ADN dans la solution7. Cette approche indirecte est sujette à l’erreur de l’opérateur en raison de la variabilité de la technique et la procédure détruit l’information sur le phénotype du cancer et le micro-environnement. Les variations de l’essai de chambre Boyden impliquent la fixation des cellules migratrices qui restent sur la membrane, mais fournit seulement un compte des cellules qui ne sont plus viables pour l’étude continue6,8,9.
En raison des limites de la chambre Boyden et de la croissance des innovations dans la communauté microfluidique, des puces d’essai de migration ont été développées qui observent le mouvement des cellules en réponse à un stimulus dans une direction plutôt que trois10,11,12. Ces essais de migration facilitent le contrôle de facteurs tels que le débit ou la séparation à cellule unique13,14 qui permettent une meilleure interprétation des résultats; cependant, leur format 2D perd inévitablement une certaine information dynamique. Des études récentes ont porté sur l’extravasation (c.-à-d. le mouvement des cellules de la circulation dans un tissu, comme la barrière hémato-encéphalique) dans un environnement 3D14,15. La distance d’extravasation dans les tissus et le comportement de sondage qui se produit à la barrière cellulaire / membrane est plus raffiné que les mesures glanées à l’aide de la chambre Boyden ou un dispositif de migration microfluidique 2D16. Ainsi, les dispositifs qui permettent l’imagerie et l’analyse appropriées de l’extravasation 3D sont essentiels pour capturer ces mesures sophistiquées, mais manquent dans la littérature.
Indépendamment des tests de migration, des techniques d’imagerie robustes ont été développées pour l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et la tomographie qui sont capables d’identifier et de reconstruire avec précision les tissus dans l’espace 3D17,18. Ces techniques acquièrent des images dans des piles z et segmentent des parties de l’image en fonction des propriétés du tissu, puis convertissent les images segmentées en mailles tridimensionnelles19,20,21. Cela permet aux médecins de visualiser en 3D des organes individuels, des os et des vaisseaux pour aider à la planification chirurgicale ou aider au diagnostic du cancer ou des maladies cardiaques22,23. Ici, nous montrerons que ces approches peuvent être adaptées pour être utilisées sur des spécimens microscopiques et des dispositifs d’extravasation 3D.
À cette fin, nous avons développé la technique de tomographie confocale innovante, présentée ici, qui offre la flexibilité pour étudier l’extravasation des cellules tumorales à travers une membrane en adaptant les outils de tomographie existants. Cette approche permet l’étude de toute la gamme des comportements des cellules cancéreuses comme ils interagissent avec une barrière cellulaire, comme une couche de cellules endothéliales. Les cellules cancéreuses présentent des comportements de sondage; certains peuvent envahir mais rester près de la membrane, tandis que d’autres traversent facilement la barrière. Cette technique est capable de produire des informations sur le phénotype de la cellule dans toutes les dimensions24. L’utilisation de cette approche pour étudier le TME est à la fois relativement peu coûteuse, facile à interpréter et reproductible, par rapport à des modèles murins in vivo plus complexes. La méthodologie présentée devrait fournir une base solide pour l’étude de nombreux types de tumeurs et de micro-environnements en adaptant la région stromale.
Nous décrivons et démontrons l’utilisation d’une plate-forme de niche du cerveau du sang microfluidique 3D (μmBBN)(figure 1)où des éléments critiques de la barrière et de la niche (cellules endothéliales microvasculaires du cerveau et astrocytes) peuvent être cultivés pendant une période prolongée (environ jusqu’à 9 jours), par une microscopie confocale et les images reconstruites à l’aide de notre technique de tomographie confocale (Figure 2); tous visaient à comprendre le développement de la micro-métastase et des changements au micro-environnement tumoral d’une manière répétable et quantitative. L’interface de barrière hémato-encéphalique avec la niche de cerveau est composée des cellules endothéliales microvasculaires de cerveau qui sont renforcées par la membrane de sous-sol, les pieds d’astrocyte, et les péricytes25. Nous nous sommes concentrés sélectivement sur les composants astrocytes et endothéliales étant donné leur importance dans la formation et la régulation de la barrière hémato-encéphalique. Nous démontrons comment fabriquer, semer, image, et analyser les cellules cancéreuses et les composants cellulaires et humoristiques de micro-environnement de tumeur, utilisant cette plate-forme. Enfin, nous montrons comment l’apprentissage automatique peut être utilisé pour identifier les différences phénotypiques intrinsèques des cellules cancéreuses qui sont capables de transiter par un modèle μmBBN et de leur attribuer un indice objectif du potentiel métastatique du cerveau24. Les ensembles de données générés par cette méthode peuvent être utilisés pour répondre à des questions de base et translationnelles sur les métastases, les stratégies thérapeutiques et le rôle du TME dans les deux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons développé et présenté une nouvelle méthode qui adapte les outils souvent utilisés dans les analyses d’imagerie clinique pour la mesure de l’extravasation et la migration des cellules cancéreuses par une barrière endothéliale dans le tissu cérébral. Nous posons cette approche peut être utile pour les mesures in vivo et in vitro; nous avons démontré son utilisation sur un système microfluidique 3D récapitulant la vasculature de cerveau. Les mesures des cellules cancéreuses, y compris la dist…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Laboratoire Steeg, à l’Institut national du cancer, pour le don généreux de cellules MDA-MB-231-BR-GFP. La microscopie confocale a été réalisée à l’Institut des biointerfaces de l’Université du Michigan (BI). La cytométrie de flux a été exécutée au noyau de cytométrie de flux de l’université du Michigan. Les vecteurs viraux ont été créés par l’Université du Michigan Vector Core. Nous remercions également Kelley Kidwell pour ses conseils en analyse statistique de ces données.
Financement:
Le C.R.O. a été partiellement appuyé par une bourse de formation T-32 des NIH (T32CA009676) et 1R21CA245597-01. T.M.W. a été partiellement soutenu par 1R21CA245597-01 et le National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health sous le numéro de prix UL1TR002240. Le financement du matériel et de la caractérisation a été fourni par l’Institut national du cancer des National Institutes of Health sous le numéro de prix 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation, et la Fondation de recherche sur le cancer du sein. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
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