Quantificando o microambique do tumor metastático cerebral usando um modelo 3D de chip de órgão, aprendizado de máquina e tomografia confocal
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para preparar e esculpir uma barreira cerebral sanguínea microambienta tumoral metastático e, em seguida, quantificar seu estado usando imagens confocal e inteligência artificial (machine learning).
Abstract
Metástases cerebrais são as lesões de câncer mais letais; 10-30% de todos os cânceres metástases no cérebro, com uma sobrevida mediana de apenas ~5-20 meses, dependendo do tipo de câncer. Para reduzir a carga do tumor metastático cerebral, as lacunas no conhecimento básico e translacional precisam ser abordadas. Os principais desafios incluem a escassez de modelos pré-clínicos reprodutíveis e ferramentas associadas. Modelos tridimensionais de metástase cerebral podem produzir os dados moleculares e fenotípicos relevantes usados para atender a essas necessidades quando combinados com ferramentas de análise dedicadas. Além disso, em comparação com os modelos de murina, modelos de células tumorais de pacientes que atravessam a barreira cerebral do sangue no microambiente cerebral geram resultados rapidamente e são mais interpretáveis com métodos quantitativos, assim, favoráveis a testes de alto rendimento. Aqui descrevemos e demonstramos o uso de uma nova plataforma de nicho cerebral microfluido 3D (μmBBN), onde múltiplos elementos do nicho podem ser cultivados por um longo período (vários dias), fluorescentemente imagens por microscopia confocal, e as imagens reconstruídas usando uma técnica inovadora de tomografia confocal; todos visavam compreender o desenvolvimento da micro metástase e mudanças no microambiente tumoral (TME) de forma repetível e quantitativa. Demonstramos como fabricar, sementes, imagem e analisar as células cancerígenas e componentes celulares e humorais TME, utilizando essa plataforma. Além disso, mostramos como a inteligência artificial (IA) é usada para identificar as diferenças fenotípicas intrínsecas das células cancerosas que são capazes de transitar através de um modelo μmBBN e atribuir-lhes um índice objetivo de potencial metastático cerebral. Os conjuntos de dados gerados por esse método podem ser utilizados para responder a questões básicas e translacionais sobre metástase, a eficácia das estratégias terapêuticas e o papel do TME em ambos.
Introduction
Metástases cerebrais são as lesões de câncer mais letais; 10-30% de todos os cânceres metástases no cérebro, com uma sobrevida mediana de apenas ~5-20 meses, dependendo do câncer tipo1,2. Uma questão principal que surge ao estudar a metástase do câncer é como sub clones migram do ambiente humorístico da corrente sanguínea para um órgão como o cérebro3,,4. Esta questão levou a muitas variações de ensaios migratórios, de invasão e extravasação. Todos esses métodos compartilham o passo crítico de contagem ou medição de propriedades de células que se movem de um local para outro em resposta a um estímulo. A maioria dos ensaios migratórios prontamente disponíveis são usados para estudar a migração bidimensional (2D) de células cancerígenas. Estes elucidaram uma riqueza de conhecimento; no entanto, eles não recapitulam a natureza tridimensional do sistema in vivo que outros métodos podem fornecer5. Portanto, é necessário estudar o microambiente tumoral (TME) em sistemas tridimensionais (3D), mas as abordagens de análise disponíveis para estruturas 3D são limitadas e muitas vezes inconsistentes.
Uma das ferramentas 3D mais populares é uma câmara de Boyden que consiste em uma membrana suspensa no fundo de um poço, separando duas regiões distintas. Boyden introduziu o ensaio para estudar leucócito chemotaxis4. As regiões inferiores podem ser variadas por química ou outras médias6,7 para induzir células na região superior a migrar para a região inferior. A abordagem mais comum para quantificar o número de células que migraram é liberar as células da parte inferior da membrana usando uma solução tampão, lise-las e, em seguida, contá-las com base na quantidade de conteúdo de DNA na solução7. Essa abordagem indireta é propensa a erros do operador devido à variabilidade técnica e o procedimento destrói informações sobre o fenótipo do câncer e o microambiental. As variações do ensaio da câmara de Boyden envolvem a fixação de células migratórias que permanecem na membrana, mas apenas fornece uma contagem de células que não são mais viáveis para o estudo continuado6,,8,9.
Devido às limitações da câmara de Boyden e ao crescimento das inovações na comunidade microfluidica, foram desenvolvidos chips de ensaio migratório que observam o movimento das células em resposta a um estímulo em uma direção em vez de três10,,11,12. Esses ensaios migratórios facilitam o controle sobre fatores como fluxo ou separação celular única13,14 que permitem melhor interpretação dos resultados; no entanto, seu formato 2D inevitavelmente perde algumas informações dinâmicas. Estudos recentes têm focado na extravasão (ou seja, o movimento das células de circulação para um tecido, como a barreira cerebral do sangue) em um ambiente 3D14,15. A distância de extravasação no tecido e no comportamento de sondagem que ocorre na barreira/membrana celular é mais refinada do que as medidas obtidas usando a câmara de Boyden ou um dispositivo de migração microfluida 2D16. Assim, dispositivos que permitem imagens adequadas e análise de extravasação 3D são fundamentais para capturar essas medidas sofisticadas, mas faltam na literatura.
Independente dos ensaios migratórios, técnicas robustas de imagem foram desenvolvidas para ressonância magnética (RM) e tomografia que são capazes de identificar e reconstruir com precisão tecido no espaço 3D17,18. Essas técnicas adquirem imagens em pilhas de z e segmentos da imagem com base nas propriedades do tecido e, em seguida, convertem as imagens segmentadas em malhas tridimensionais19,,20,,21. Isso permite que os médicos visualizem em órgãos, ossos e vasos individuais em 3D para auxiliar no planejamento cirúrgico ou auxiliar no diagnóstico de câncer ou doença cardíaca22,23. Aqui, mostraremos que essas abordagens podem ser adaptadas para uso em espécimes microscópicos e dispositivos de extravasação 3D.
Para isso, desenvolvemos a inovadora técnica de tomografia confocal, aqui apresentada, que proporciona flexibilidade para estudar a extravasão das células tumorais através de uma membrana, adaptando ferramentas de tomografia existentes. Essa abordagem permite o estudo de toda a gama de comportamentos de células cancerosas à medida que interagem com uma barreira celular, como uma camada celular endotelial. Células cancerígenas apresentam comportamentos de sondagem; alguns podem invadir, mas permanecem perto da membrana, enquanto outros atravessam a barreira prontamente. Esta técnica é capaz de produzir informações sobre o fenótipo da célula em todas as dimensões24. Usar essa abordagem para estudar o TME é relativamente barato, fácil de interpretar e reprodutível, quando comparado com modelos in vivo murine mais complexos. A metodologia apresentada deve fornecer uma base forte para o estudo de muitos tipos de tumores e microambi ambientes, adaptando a região estromal.
Descrevemos e demonstramos o uso de uma plataforma 3D microfluidicaFigure 1do cérebro do sangue (μmBBN) onde elementos críticos da barreira e do nicho (células endoteliais microvasculares cerebrais e astrócitos) podem ser cultivados por um período prolongado (aproximadamente até 9 dias), fluorescentemente imagens por microscopia confocal, e as imagens reconstruídas usando nossa técnica de tomografia confoccal (Figura 2); todos visavam compreender o desenvolvimento da micro metástase e mudanças no microambiente tumoral de forma repetível e quantitativa. A interface da barreira cerebral sanguínea com o nicho cerebral é composta de células endoteliais microvasculares cerebrais que são reforçadas por membrana do porão, pés de astrócito e pericitos25. Nós nos concentramos seletivamente nos componentes astrócitos e endoteliais dada a sua importância na formação e regulação da barreira cerebral do sangue. Demonstramos como fabricar, sementes, imagem e analisar as células cancerígenas e componentes celulares e humorísticos do tumor, utilizando essa plataforma. Finalmente, mostramos como o aprendizado de máquina pode ser usado para identificar as diferenças fenotípicas intrínsecas das células cancerosas capazes de transitar através de um modelo μmBBN e atribuir-lhes um índice objetivo de potencial metastático cerebral24. Os conjuntos de dados gerados por este método podem ser usados para responder perguntas básicas e translacionais sobre metástase, estratégias terapêuticas e o papel do TME em ambos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desenvolvemos e apresentamos um novo método que adapta ferramentas frequentemente utilizadas em análises de imagem clínica para medição de extravasação e migração de células cancerígenas através de uma barreira endotelial no tecido cerebral. Nós colocamos essa abordagem pode ser útil tanto para medições in vivo quanto in vitro; demonstramos seu uso em um sistema microfluido 3D recapitulando vasculatura cerebral. As medidas de células cancerígenas, incluindo distância extravasada, percentual extravasado…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Laboratório Steeg, do Instituto Nacional de Câncer, pela generosa doação de células MDA-MB-231-BR-GFP. A microscopia confocal foi realizada no Instituto de Biointerfaces da Universidade de Michigan (BI). A citometria de fluxo foi realizada no Núcleo de Citometria de Fluxo da Universidade de Michigan. Vetores virais foram criados pelo Núcleo vetorial da Universidade de Michigan. Agradecemos também a Kelley Kidwell pela orientação na análise estatística desses dados.
Financiamento:
A C.R.O. foi parcialmente apoiada por uma Bolsa de Treinamento NIH T-32 (T32CA009676) e 1R21CA245597-01. T.M.W. foi parcialmente apoiado pelo 1R21CA245597-01 e pelo Centro Nacional de Promoção de Ciências Translacionais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número UL1TR002240. O financiamento para materiais e caracterização foi fornecido pelo Instituto Nacional de Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio nº 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, Fundação METAvivor e Fundação de Pesquisa do Câncer de Mama. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
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