Количественная оценка микро-среды метастатической опухоли мозга с помощью 3D-модели Organ-On-A Chip, машинного обучения и конфокальцной томографии
Summary
Здесь мы представляем протокол для подготовки и культивирования метастатического геммозефалического барьера микро-среды опухоли, а затем количественно его состояние с использованием конфокальных изображений и искусственного интеллекта (машинное обучение).
Abstract
Метастазы мозга являются наиболее смертоносными поражениями рака; 10-30% всех раковых метастазов в мозг, со средним выживанием всего 5-20 месяцев, в зависимости от типа рака. Чтобы уменьшить бремя метастатических опухолей мозга, необходимо решить пробелы в базовых и переводческих знаниях. Основные проблемы включают нехватку воспроизводимых доклинических моделей и связанных с ними инструментов. Трехмерные модели метастазирования мозга могут дать соответствующие молекулярные и фенотипические данные, используемые для удовлетворения этих потребностей в сочетании с специализированными инструментами анализа. Кроме того, по сравнению с моделями мурина, орган-на-чип модели опухолевых клеток пациента, проходящих геммоэнцефалический барьер в микроокноронику мозга генерировать результаты быстро и более интерпретируются с количественными методами, таким образом, под силу высокой пропускной способности тестирования. Здесь мы описываем и демонстрируем использование новой 3D микрофлюидной ниши мозга крови (МКББН), где несколько элементов ниши можно культурировал в течение длительного периода (несколько дней), флуоресцентно изображены конфокальные микроскопии, и изображения реконструированы с использованием инновационной конфокальные томографии техники; все они направлены на то, чтобы понять развитие микро-метастазов и изменений в микро-среде опухоли (TME) в повторяемой и количественной манере. Мы демонстрируем, как изготовить, семена, изображения, и анализировать раковые клетки и TME клеточных и гуморальных компонентов, используя эту платформу. Кроме того, мы показываем, как искусственный интеллект (ИИ) используется для выявления внутренних фенотипических различий раковых клеток, способных проходить через модель мБН, и присваивать им объективный индекс метастатического потенциала мозга. Наборы данных, генерируемые этим методом, могут быть использованы для ответа на основные и трансляционные вопросы о метастазах, эффективности терапевтических стратегий и роли TME в обоих.
Introduction
Метастазы мозга являются наиболее смертоносными поражениями рака; 10-30% всех раковых метастазов в мозг, со средним выживанием только 5-20 месяцев, в зависимости оттипа рака 1,2. Основной вопрос, который возникает при изучении метастазов рака, как суб клоны мигрируют из гуморальной среды кровотока в орган,такой как мозг 3,,4. Этот вопрос привел к многим вариациям миграции, вторжения и экстравазии анализов. Все эти методы разделяют критический шаг подсчета или измерения свойств клеток, которые перемещаются из одного места в другое в ответ на стимул. Большинство миграционных анализов легко доступны используются для изучения двумерной (2D) миграции раковых клеток. Они прояснены богатство знаний; однако, они не резюмируют трехмерный характер системы in vivo, что другие методы могут обеспечить5. Поэтому необходимо изучать микросреду опухоли (ТМЭ) в трехмерных (3D) системах, но подходы к анализу, доступные для 3D-структур, ограничены и зачастую несовместимы.
Одним из самых популярных 3D-инструментов является камера Boyden, которая состоит из мембраны, подвешенной в нижней части колодеца, разделяющей два отдельных региона. Бойден ввел анализ для изучения лейкоцитов хемотаксис4. Нижние регионы могут быть разнообразны по химии или другимсредствам 6,,7, чтобы побудить клетки в верхнем регионе мигрировать в нижнюю область. Наиболее распространенным подходом к количественной оценке количества клеток, которые мигрировали является освобождение клеток из нижней части мембраны с помощью буферного раствора, подставить их, а затем подсчитать их на основе количества содержания ДНК врастворе 7. Этот косвенный подход подвержен ошибке оператора из-за изменчивости техники и процедура уничтожает информацию о фенотипе рака и микро-среде. Вариации анализа камеры Бойдена включают фиксацию мигрирующих клеток, которые остаются на мембране, но только обеспечивает количество клеток, которые больше не являются жизнеспособными длядальнейшего изучения 6,,8,,9.
Из-за ограничений камеры Бойдена и роста инноваций в микрофлюидном сообществе, были разработаны чипы миграционного анализа, которые наблюдают движение клеток в ответ на стимул в одном направлении, а нетри 10,,11,12. Эти миграционные анализы облегчают контроль над такими факторами, как поток или разделениеодной ячейки 13,14, которые позволяют лучше работать над результатами;, однако их 2D-формат неизбежно теряет некоторую динамическую информацию. Недавние исследования были сосредоточены на экстравазии (т.е. движение клеток из циркуляции в ткани, такие как гемовоградный барьер) в 3Dсреде 14,15. Экстравазия расстояние в ткани и зондирования поведение, которое происходит на клеточном барьере / мембраны более изысканным, чем измерения почерпнутые с помощью либо камеры Бойден или 2D микрофлюидных миграцииустройства 16. Таким образом, устройства, позволяющие осуществлять соответствующую визуализацию и анализ 3D-экстравазии, имеют решающее значение для фиксации этих сложных измерений, но отсутствуют в литературе.
Независимо от миграционных анализов, были разработаны надежные методы визуализации для магнитно-резонансной томографии (МРТ) и томографии, которые способны идентифицировать и точно реконструировать ткани в 3Dпространстве 17,,18. Эти методы приобретают изображения в z-стеках и сегментных части изображения на основе свойств ткани, а затем преобразуют сегментированные изображения втрехмерные сетки 19,,20,,21. Это позволяет врачам визуализировать в 3D отдельных органов, костей и сосудов, чтобы помочь в хирургическом планировании или помощи в диагностикерака или сердечных заболеваний 22,23. Здесь мы покажем, что эти подходы могут быть адаптированы для использования на микроскопических образцах и 3D-устройствах экстравасации.
С этой целью мы разработали инновационный метод конфокальные томографии, представленный в настоящем, который обеспечивает гибкость для изучения экстравазации опухолевых клеток через мембрану путем адаптации существующих томографических инструментов. Этот подход позволяет изучить всю гамму поведения раковых клеток, как они взаимодействуют с клеточным барьером, таких как эндотелиальный слой клеток. Раковые клетки обладают зондирующим поведением; некоторые из них могут вторгнуться, но остаются близко к мембране, в то время как другие пересекают барьер легко. Этот метод способен дать информацию о фенотипе клетки во всех измерениях24. Использование этого подхода для изучения TME является относительно недорогим, простым в интерпретации и воспроизводимым, по сравнению с более сложными моделями in vivo murine. Представленная методология должна обеспечить сильную основу для изучения многих типов опухолей и микро-сред путем адаптации стромальной области.
Мы описываем и демонстрируем использование 3D микрофлюидной ниши мозга крови (мББН) платформы(рисунок 1),где критические элементы барьера и ниши (микрососудистые эндотелиальные клетки мозга и астроциты) могут быть отучены в течение длительногопериода (примерно до 9 дней), флуоресцентно изображены с помощьюконфокальной микроскопии, а изображения реконструированы с использованием нашей конфокалиограммы . все направлено на понимание развития микро-метастазов и изменений в микро-среде опухоли в повторяемой и количественной манере. Интерфейс гемового барьера с нишей мозга состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток мозга, которые укрепляются мембраной подвала, астроцитными ногами иперицитами 25. Мы избирательно сосредоточились на астроцитах и эндотелиальных компонентах, учитывая их важность в формировании и регуляции геммоградно-мозгового барьера. Мы демонстрируем, как изготовить, семена, изображения, и анализировать раковые клетки и опухолевые микро-среды клеточных и гуморальных компонентов, используя эту платформу. Наконец, мы показываем, как машинное обучение может быть использовано для выявления внутренних фенотипических различий раковых клеток, которые способны проходить через модель мББН и присвоить им объективный индекс метастатическогопотенциала мозга 24. Наборы данных, генерируемые этим методом, могут быть использованы для ответа на основные и трансляционные вопросы о метастазах, терапевтических стратегиях и роли TME в обоих.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали и представили новый метод, который адаптирует инструменты, часто используемые в клинических анализах изображений для измерения экстравазии и миграции раковых клеток через эндотелиальный барьер в ткани мозга. Мы считаем, что такой подход может быть полезен как для измер…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим лабораторию Steeg в Национальном институте рака за щедрое пожертвование клеток MDA-MB-231-BR-GFP. Конфокальцная микроскопия была проведена в Институте биоинтерфейсов Мичиганского университета (BI). Цитометрия потока была выполнена в Университете Мичигана поток цитометрии ядра. Вирусные векторы были созданы Университетом Мичигана Vector Core. Мы также благодарим Келли Кидвелл за руководство в статистическом анализе этих данных.
Финансирования:
C.R.O. была частично поддержана стипендией NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) и 1R21CA245597-01. T.M.W. была частично поддержана 1R21CA245597-01 и Национальным центром продвижения переводческих наук Национальных институтов здравоохранения под номером UL1TR002240. Финансирование материалов и характеристики было предоставлено Национальным институтом рака Национальных институтов здравоохранения под номером 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, Фонд METAvivor, и Фонд исследований рака молочной железы. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точки зрения Национальных институтов здравоохранения
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
References
- Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
- Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
- Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
- Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
- Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. . The Visualization Toolkit. 4th edn. , (2006).
- Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
- Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
- Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
- Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
- Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
- Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
- Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
- Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
- Badilescu, S., Packirisamy, M. . BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , (2011).
- Liu, C. . Foundations of MEMS. 2nd edn. , (2012).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
- Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , (2020).
- Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
- Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. . Applied regression analysis and other multivariable methods. , (1978).
- Berg, M. d. . Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , (2000).
- Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
- Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Recherche en cancérologie. 40 (9), 3118-3129 (1980).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
- Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
- Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
- Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
- Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).
