Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji
Summary
Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.
Abstract
Hücre fenotipi, her tekniğe özgü avantajlar ve sınırlamalar ile farklı yöntemlerle tersine çevrilebilir veya değiştirilebilir. Burada, memeli pluripotent hücreleri üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren yeni bir strateji açıklıyoruz. İki ana adım gereklidir. İlk adımda, yetişkin olgun (ölümcül olarak farklılaşmış) hücreler, onları pluripotent bir duruma sokmak için epigenetik silgi 5-aza-sitidine maruz bırakılır. Protokolün bu kısmı, hücre kaderini ve farklılaşmasını kontrol eden epigenetik mekanizmaların artan anlayışına dayanarak geliştirilmiştir ve hücre farklılaşmış durumunu silmek ve daha sonra geçici bir yüksek plastisite penceresine sürmek için epigenetik değiştiricinin kullanılmasını içerir.
İkinci adımda, silinen hücreler, elde edilen yüksek plastisiteyi genişletmek ve istikrarlı bir şekilde korumak için 3D hücre yeniden düzenlemesini teşvik etmek için Sıvı Mermerler olarak da bilinen politetrafloroetilen (PTFE) mikro-biyoreaktörlerde kapsüllenir. PTFE, reaktif olmayan hidrofobik sentetik bir bileşiktir ve kullanımı, geleneksel 2D kültür sistemlerinde elde edilemeyen hücresel bir mikro çevrenin oluşturulmasına izin verir. Bu sistem, biyo-mekanosensing ile ilgili ipuçları olsa da, pluripotensinin korunmasını teşvik eder ve artırır.
Burada açıklanan teknik prosedürler, yetişkin somatik hücrelerde yüksek plastisite durumunun indüksiyonuna ve korunmasına izin veren basit stratejilerdir. Protokol, test edilen tüm memeli türlerinde yüksek plastisiteli hücrelerin türetilmesine izin verdi. Gen transfeksiyonu kullanımını içermediğinden ve viral vektörlerden arındırılmış olduğundan, translasyonel tıp uygulamaları için dikkate değer bir teknolojik ilerlemeyi temsil edebilir. Ayrıca, mikro-biyoreaktör sistemi, in vitro olarak yüksek plastisiteli hücrelerin, yani ESC’ler, iPSC’ler, epigenetik olarak silinmiş hücreler ve MSC’ler gibi uzun vadeli kültürüne izin veren belirli bir mikro ortamı yeniden yaratarak kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerleme sağlar.
Introduction
Son on yıllarda, hücre bağlılığı ve farklılaşmasına doğru tek yönlü ilerleme kavramı tamamen gözden geçirildi. Hücre spesifikasyonunun tersine çevrilebileceği ve ölümcül olarak farklılaşmış bir hücrenin, farklı yöntemler kullanılarak daha az kararlı ve daha yüksek izin verilen bir duruma itilebileceği gösterilmiştir.
Önerilen çeşitli yöntemler arasında, en umut verici yöntemlerden biri, hücreleri kimyasal olarak indüklenen pluripotens olarak adlandırılan bir şeye indüklemek için kimyasal bileşiklerin kullanılmasını içerir. Bu yaklaşımda kullanılan küçük moleküller, yetişkin bir olgun hücrenin epigenetik imzasını etkileşime sokabilir ve değiştirebilir, herhangi bir transgenik ve / veya viral vektöre ihtiyaç duymaz, 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Son zamanlarda yapılan çok sayıda çalışma, hipermetillenmiş genlerin11,12,13,14,15 reaktivasyonunu indükleyen spesifik biyokimyasal ve biyolojik uyaranlar sağlayarak hücreleri bir fenotipten diğerine geçirmenin mümkün olduğunu göstermiştir. Bu demetilasyon olayları, ölümcül olarak farklılaşmış hücrelerin ilkel bir progenitöre, multipotent veya yüksek plastisiteye / pluripotent bir hücreye dönüştürülmesine izin verir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Buna paralel olarak, birçok çalışma son zamanlarda mekanosensing ile ilgili ipuçlarının anlaşılmasına ve daha spesifik olarak, hücre plastisitesini ve / veya farklılaşmasını doğrudan etkilemek için mekanik kuvvetlerin kullanılması olasılığına odaklanmaktadır16,17,18,19. Gerçekten de, hücre dışı matrisin (ECM) hücre kaderinin kontrolünde önemli bir rol oynadığı açıkça gösterilmiştir. Özellikle, ECM tarafından üretilen biyomekanik ve biyofiziksel sinyaller, moleküler mekanizmaları ve sinyal yollarını doğrudan düzenleyerek hücre davranışını ve işlevlerini etkiler20,21. Bu son veriler, in vivo hücre mikro ortamını daha yakından taklit eden, hücre davranışını yönlendiren mekanik ve fiziksel uyaranları kopyalayan yeni 3D kültür sistemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır.
Burada, memeli pluripotent hücreleri üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren iki aşamalı bir protokolü açıklıyoruz. İlk adımda, hücreler demetilasyon molekülü 5-aza-sitidin (5-aza-CR) ile inkübe edilir. Bu ajan, doğrudan on-onbir translokasyon 2 (TET2) aracılı etki8,10 ve DNA metiltransferazların (DNMT) 22,23’ün dolaylı inhibisyonunun birleşik bir etkisi ile önemli bir küresel DNA demetilasyonunu indükleyebilir. Bu adım, pluripotens ile ilişkili gen ekspresyonunun daha sonra yeniden aktivasyonu ile epigenetik blokların uzaklaştırılmasını ve dolayısıyla bundan böyle “epigenetik olarak silinmiş hücreler” olarak adlandırılacak olan yüksek plastisiteli hücrelerin 1,2,3,8,10 üretilmesini indükler. İkinci adımda, hücreler bir 3B kültür sisteminde kapsüllenir. Bu amaçla, reaktif olmayan hidrofobik sentetik bileşik politetrafloroetilen (PTFE; 1 μm parçacık boyutuna sahip), geleneksel 2D kültür sistemlerinin kullanımıyla elde edilemeyen hücresel bir mikro ortamın oluşturulmasına izin veren mikro-biyoreaktör olarak kullanılır10. PTFE toz parçacıkları, hücrelerin yeniden askıya alındığı sıvı damlasının yüzeyine yapışır ve sıvı çekirdeği destek yüzeyinden izole ederken, iç sıvı ile çevredeki ortam arasında gaz değişimine izin verir24. Bu şekilde elde edilen ve “Sıvı Mermer” olarak da bilinen “PTFE mikro-biyoreaktör”, hücreleri birbirleriyle serbestçe etkileşime girmeye teşvik eder, 3D hücre yeniden düzenlenmesini teşvik eder25,26,27 ve biyo-mekanosensing ile ilgili ipuçları10 olsa da, elde edilen yüksek plastisite durumunu genişletir ve istikrarlı bir şekilde korur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son yıllarda, birkaç çalışma, ölümcül olarak farklılaşmış bir hücreyi daha az kararlı ve daha yüksek izin veren bir duruma geri döndürmek için stratejilerin geliştirilmesine odaklanmıştır. Burada açıklanan protokol, yetişkin olgun terminal olarak farklılaşmış hücrelerden başlayarak pluripotent hücrelerin üretilmesine ve uzun süreli bakımına izin verir. Yöntem, kimyasal epigenetik silme yoluyla elde edilen yüksek izin verilen bir durumun indüklenmesini ve ardından bir 3D kültür si…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Carraresi Vakfı ve MiND FoodS Hub ID: 1176436 tarafından finanse edildi. Tüm yazarlar COST Action CA16119 In vitro 3-D toplam hücre rehberliği ve zindeliği (CellFit) üyesidir.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
References
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
- Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333 (2015).
- Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
- Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
- Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017 (2016).
- Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
- Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
- Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
- Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2′-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
- Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2′-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).
- Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41 (2012).
- Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), 4261-4270 (2017).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
- Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
- Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083 (2015).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).
- Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
- Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).
