마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화
Summary
여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.
Abstract
전기 기화는 그들의 기능을 이해하기 위하여 세포로 특정 유전자를 전송하는 중요한 방법으로 그 자체를 설치했습니다. 여기서, 우리는 마우스 organotypic 해마 슬라이스 배양에서 흥분 및 클래스 별 억제 뉴런에서 체외 유전자 의 효율 (~80%)을 최대화하는 단세포 전기 기법을 설명합니다. 대형 유리 전극, 테트로도톡신 함유 인공 뇌척수액 및 가벼운 전기 펄스를 사용하여 배양 된 해마 CA1 피라미드 뉴런 및 억제 인터뉴런에 관심 유전자를 전달했습니다. 더욱이, 전기기화는 다양한 슬라이스 배양 발달 단계에 대한 연구를 가능하게 하는, 형질 효율의 감소없이 시험관내에서 최대 21일까지 배양 된 해마 슬라이스에서 수행될 수 있었다. 다양한 세포 유형에 걸쳐 유전자의 분자 기능을 검사하는 데 관심이 증가함에 따라, 우리의 방법은 기존의 전기 생리 장비 및 기술로 수행 할 수있는 마우스 뇌 조직에서 체외 유전자 트랜스펙트에 대한 신뢰할 수 있고 간단한 접근 방식을 보여줍니다.
Introduction
분자 생물학에서, 조사자에게 가장 중요한 고려 사항 중 하나는 그것의 기능을 해명하기 위하여 세포의 세포 또는 인구로 관심있는 유전자를 전달하는 방법입니다. 다른 전달 방법은 생물학적(예를 들어, 바이러스 벡터), 화학(예를 들어, 인산칼슘 또는 지질), 또는 물리적(예를 들어, 전기기화, 미세 주입 또는 생물리스트)1,2로분류될 수 있다. 생물학적 방법은 매우 효율적이며 세포 유형에 특이적일 수 있지만 특정 유전 도구의 개발에 의해 제한됩니다. 화학 적 접근은 시험관 내에서 매우 강력하지만, 형질은 일반적으로 무작위입니다; 추가, 이러한 접근은 주로 기본 셀에 대해서만 예약되어 있습니다. 물리적 접근법 중, 생물학은 기술적 관점에서 가장 간단하고 쉬운 방법이지만, 다시 상대적으로 낮은 효율로 무작위 형질 전환 결과를 생성합니다. 유전적 도구 개발 없이 특정 세포로 전이가 필요한 응용 의 경우, 우리는 단세포 전기기3,4를향해 바라본다.
전기포기는 전분 전기기분기만을 참조하는 데 사용되는 반면, 지난 20년 동안 여러 시험관 내 및 생체 내 단일 세포 전기기 프로토콜이 개발되어 특이성과 효율을 향상시키기 위해 개발되어5,6,7,전기포기는 개별 세포로 유전자를 전송하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 매우 정확할 수 있습니다. 그러나 절차는 기술적으로 까다롭고 시간이 많이 걸리며 상대적으로 비효율적입니다. 실제로, 최근 논문은 기계화 전기 기공 장비의 타당성을조사했다 8,9,이는 이러한 로봇 공학을 설치에 관심이 조사관을위한 이러한 장벽의 몇 가지를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 더 간단한 수단을 찾는 사람들을 위해, 전기 화, 즉 세포 죽음, 경질 실패 및 파이펫 막힘에 대한 문제는 여전히 우려사항입니다.
최근에는 더 큰 기울어진 유리 파이펫을 사용하는 전기 포기 방법을 개발했습니다. 온화한 전기 펄스 파라미터, 그리고 종신뉴런에서 훨씬 더 높은 형질전환 효율을 생성한 독특한 압력 순환 단계는 마우스 의 해마 CA1 영역에서 소마토스타틴 발현 억제 억제인터뉴런을 포함하여 억제성 인터뉴런에서 유전자를 처음으로 횡단할 수 있게하였다. 그러나, 상이한 억제 인터뉴런 유형 및 뉴런 발달 단계에서 이 전기포기 방법의 신뢰성은 해결되지 않았다. 여기서, 우리는 이 전기기 기술이 흥분성 뉴런과 인터뉴런의 다른 종류 둘 다로 유전자를 이식할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 중요한 것은, 시험관내(DIV) 슬라이스 배양 연령에 관계없이 일체내의 전환 효율이 높았다는 것이다. 이 확립 및 사용자 친화적 인 기술은 생체 외 마우스 뇌 조직의 맥락에서 다른 세포 유형에 대한 단일 세포 전기 포레이션을 사용하는 데 관심이있는 모든 조사자에게 매우 권장됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기에서 높은 효율성과 정밀도로 흥분성 및 억제 뉴런을 모두 횡단하는 전기 포기 법을 설명합니다. 당사의 최적화된 전기기화 프로토콜에는 매우 효율적인 유전자 이식을 달성하기 위한 세 가지 혁신적인 혁신이 있습니다. 우리의 첫 번째 수정은 이전에 게시 된프로토콜에비해 파이펫 크기를 증가하는 것이었습니다3,5,6<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 보조금의 국가 학회에 의해 지원되었다 (R01NS085215 K.F.에, T32 GM107000 및 F30MH122146 A.C.). 저자들은 숙련된 기술 지원을 해주신 와타나베 나오에 씨에게 감사를 표합니다.
Materials
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
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