Isolering av murine spermatogene celler ved hjelp av en violet-spent celle-gjennomtrengelig DNA bindende fargestoff
Summary
Her presenterer vi en enkel og effektiv metode for å isolere levende meiotiske og postmeiotiske bakterieceller fra voksne musetestikler. Ved hjelp av en lav cytotoksisitet, fiolett-spent DNA bindende fargestoff og fluorescens-aktivert celle sortering, man kan isolere svært beriket spermatogene cellepopulasjoner for mange nedstrøms applikasjoner.
Abstract
Isolering av meiotiske spermatocytter er avgjørende for å undersøke molekylære mekanismer underliggende meiose og spermatogenese. Selv om det er etablert celleisolasjonsprotokoller ved hjelp av Hoechst 33342 farging i kombinasjon med fluorescens-aktivert cellesortering, krever det cellesortere utstyrt med en ultrafiolett laser. Her beskriver vi en celleisolasjonsprotokoll ved hjelp av DyeCycle Violet (DCV) flekken, en lav cytotoksisitet DNA bindende fargestoff strukturelt lik Hoechst 33342. DCV kan være begeistret av både ultrafiolette og fiolette lasere, noe som forbedrer fleksibiliteten til utstyrsvalg, inkludert en cellesorter som ikke er utstyrt med en ultrafiolett laser. Ved hjelp av denne protokollen kan man isolere tre live-celle subpopulasjoner i meiotiske prophase I, inkludert leptotene / zygotene, pachytene, og diplotene spermatocytter, samt post-meiotiske runde spermatids. Vi beskriver også en protokoll for å forberede encellede suspensjon fra musetestikler. Samlet sett krever prosedyren kort tid å fullføre (4-5 timer avhengig av antall nødvendige celler), noe som letter mange nedstrøms applikasjoner.
Introduction
Spermatogenese er en kompleks prosess hvor en liten populasjon av spermatogoniale stamceller opprettholder kontinuerlig produksjon av et stort antall sperm gjennom voksenlivet1,2. Under spermatogenese finner dynamisk kromatin remodeling sted når spermatogene celler gjennomgår meiose for å produsere haploid spermatids3,4,5. Isolering av meiotiske spermatocytter er avgjørende for molekylær undersøkelse, og flere forskjellige tilnærminger for å isolere meiotiske spermatocytter er etablert, inkludert sedimenteringsbasert separasjon6,7 og fluorescensaktivert cellesortering (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Disse metodene har imidlertid tekniske begrensninger. Mens sedimenteringsbasert separasjon gir et stort antall celler5,6,7, er det arbeidskrevende. Den etablerte FACS-baserte metoden bruker Hoechst 33342 (Ho342) til å skille meiotiske spermatocytter basert på DNA-innhold og lysspøpende egenskaper og krever FACS cellesorterere utstyrt med en ultrafiolett (UV) laser8,9,10,11. Alternative FACS-baserte metoder krever transgene muselinjer som uttrykker blomstrende proteiner, synkronisering av spermatogenese12, eller cellefiksering og antistoffmerking som ikke er kompatibel med isolering av levendeceller 13. Mens det er en annen alternativ metode ved hjelp av en cellegjennomtrengelig DNA bindende fargestoff, DyeCycle Grønn flekk14,15,16,17, anbefales denne metoden for isolering av spermatogene celler fra juvenil testis. Derfor er det et kritisk behov for å utvikle en enkel og robust isolasjonsmetode for levende meiotiske spermatocytter som kan brukes på enhver musestamme i alle aldre, og som kan utføres ved hjelp av hvilken som helst FACS-cellesortering.
Her beskriver vi en så ettertraktet celleisolasjonsprotokoll ved hjelp av DyeCycle Violet (DCV) flekken. DCV er en lav cytotoksisitet, cellegjennomtrengelig DNA bindende fargestoff strukturelt lik Ho342, men med et eksitasjonsspektrum forskjøvet mot fiolettområde 18. I tillegg har DCV et bredere utslippsspektrum sammenlignet med DCG. Dermed kan det være begeistret av både UV og fiolette lasere, noe som forbedrer fleksibiliteten til utstyr, slik at bruk av en FACS cellesortering som ikke er utstyrt med en UV-laser. DCV-protokollen som presenteres her bruker todimensjonal separasjon med DCV blå og DCV rød, etterligne fordelen av Ho342-protokollen. Med denne fordelen tillater vår DCV-protokoll oss å isolere høyt berikede bakterieceller fra de voksne testiene. Vi tilbyr en detaljert gating protokoll for å isolere levende spermatogene celler fra voksne mus testiklene av en mus (fra to testiklene). Vi beskriver også en effektiv og rask protokoll for å forberede encellede suspensjon fra musetestiklene som kan brukes til denne celleisoleringen. Prosedyren krever kort tid å fullføre (utarbeidelse av enkeltcellesuspensjon – 1 time, fargestofffarging – 30 min og cellesortering – 2-3 timer: totalt – 4-5 timer avhengig av antall nødvendige celler; Figur 1). Etter celleisolasjon kan et bredt spekter av nedstrøms programmer, inkludert RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq og cellekultur, fullføres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenterer vi en praktisk og enkel protokoll for å isolere underpopulasjoner av spermatocytter og spermatider fra en enkelt voksen mannlig mus. For å sikre reproduserbarheten til denne protokollen, er det noen kritiske skritt som trenger oppmerksomhet. Før enzymfordøyelse tar vasketrinnet sikte på å fjerne interstitielle celler; etter fordøyelsen bidrar dette trinnet til å fjerne spermatozoer og rusk. Vasking/sentrifugering 3 ganger er viktig. I vår dissosiasjonsbufferoppskrift letter kombinasjonen av flere…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer av Namekawa, Yoshida og Maezawa laboratorier for deres hjelp; Katie Gerhardt for redigering av manuskriptet; Mary Ann Handel for å dele H1T-antistoffet, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core for deling av FACS-utstyret støttet av NIH S10OD023410; Stipend-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI; 17K07424) til T.N.; Lalor Foundation postdoktorstipend til A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) til S.Y.; forskningsprosjektstipendet fra Azabu University Research Services Division, Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT)-støttet program for Private University Research Branding Project (2016–2019), Grant-in-Aid for Research Activity Oppstart (19K21196), Takeda Science Foundation (2019) og Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) til S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 til S.H.N.
Materials
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Hostone H1T antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Biologie du développement. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Biologie du développement. 169 (2), 557-567 (1995).
