في المختبر ثقافة قشرة المبيض البقري وتأثير الغذائية درج خطوة النظام الغذائي على البيئة الدقيقة المبيض هو تقديم. تم استزراع قطع قشرة المبيض لمدة سبعة أيام وتم تقييم المنشطات والسيتوكينات ومراحل الجريب. وكان العلاج النظام الغذائي درج الخطوة زيادة تولد الستيرويد مما أدى إلى تطور الجريب في الثقافة.
تطور الجريبات من المرحلة البدائية إلى المرحلة الأنترالية هو عملية ديناميكية داخل قشرة المبيض ، والتي تشمل عوامل الغدد الصماء والباراكرين من الخلايا الجسدية والتواصل بين الخلايا الركامية. لا يعرف الكثير عن البيئة المجهرية المبيض وكيف تؤثر السيتوكينات والمنشطات المنتجة في الوسط المحيط على تطور الجريب أو الاعتقال. في المختبر ثقافة قشرة المبيض تمكن بصيلات لتطوير في بيئة طبيعية التي لا تزال مدعومة من قبل ستروما المجاورة. كان هدفنا هو تحديد تأثير النظام الغذائي الدرج الخطوة الغذائية على البيئة الدقيقة المبيض (تطوير المسام, الستيرويد, وإنتاج السيتوكين) من خلال الثقافة المختبرية من قشرة المبيض البقري. ولتحقيق ذلك، أزيلت قطع قشرية المبيض من الهيفرات التي تخضع لنظامين مختلفين تم تطويرهما غذائيا قبل البلوغ: التحكم (تطوير التغذية التقليدية) ودرج الخطوة (التغذية وتقييد أثناء التنمية) التي تم قطعها إلى ما يقرب من 0.5-1 ملم3 قطع. تم تمرير هذه القطع في وقت لاحق من خلال سلسلة من يغسل ووضعها على إدراج ثقافة الأنسجة التي يتم تعيينها في بئر تحتوي على وسيلة ثقافة وايموث. تم استزراع قشرة المبيض لمدة 7 أيام مع تغييرات وسائل الإعلام الثقافية اليومية. تم إجراء قسم النسيج لتحديد التغيرات مرحلة الجريب قبل وبعد الثقافة لتحديد آثار التغذية وتأثير الثقافة دون علاج إضافي. تم تجميع القشرة الثقافة المتوسطة على مدى أيام لقياس المنشطات, نواتج الأيض الستيرويد, والسيتوكينات. كانت هناك ميول لزيادة هرمونات الستيرويد في البيئة الدقيقة المبيض التي سمحت لتطور الجريب في الثقافات درج الخطوة مقابل التحكم قشرة المبيض. تسمح تقنية ثقافة قشرة المبيض بفهم أفضل للبيئة الدقيقة المبيضية ، وكيف يمكن أن تؤثر التعديلات في إفراز الغدد الصماء على تطور الجريب ونموه من كل من العلاجات الحية وفي المختبر. قد تكون طريقة الثقافة هذه مفيدة أيضا لاختبار العلاجات المحتملة التي قد تحسن تطور الجريب لدى النساء لتعزيز الخصوبة.
تمثل قشرة المبيض الطبقة الخارجية للمبيض حيث يحدث تطور الجريبات1. سيتم تنشيط بصيلات البدائية ، التي تم القبض عليها في البداية في التنمية ، لتصبح بصيلات أولية أو ثانوية أو ثلاثية بناء على مدخلات الباراكرين والغدد الصماء1و2و3و4. لفهم العمليات الفسيولوجية داخل المبيض بشكل أفضل ، يمكن استخدام زراعة الأنسجة كنموذج في المختبر ، مما يسمح لبيئة خاضعة للرقابة بإجراء التجارب. وقد استخدمت العديد من الدراسات زراعة أنسجة المبيض للبحوث في التكنولوجيا الإنجابية بمساعدة, الحفاظ على الخصوبة, وسرطان المبيض5,6,7. وقد عملت أيضا زراعة أنسجة المبيض كنموذج للتحقيق في السموم الإنجابية التي تضر بصحة المبيض ومسببات الاضطرابات التناسلية مثل متلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS)8و9و10و11. وبالتالي، ينطبق هذا النظام الثقافي على مجموعة واسعة من التخصصات.
في القوارض ، تم استخدام النجن الجنيني أو ما حول الولادة في تجارب البيولوجيا الإنجابية12،13،14،15. ومع ذلك، لا يمكن استزراع النجانات من الماشية المحلية الكبيرة كأعضاء كاملة بسبب حجمها الكبير وانحطاطها المحتمل. لذلك ، يتم قطع قشرة المبيض الرئيسيات غير البشرية إلى قطع أصغر16،17،18. وقد استزراع العديد من الدراسات قطع قشرة المبيض الصغيرة لدراسة عوامل النمو المختلفة (ق) في بدء الجريب البدائي في الماشية المنزلية والرئيسيات غير البشرية1،17،18،19. وقد أظهر استخدام ثقافة قشرة المبيض أيضا بدء الجريبات البدائية في غياب المصل للقطع القشرية البقرية والرئيسيات المستزرعة لمدة 7 أيام20. يانغ وفورتشن في عام 2006 تعامل الجنين قشرة المبيض ثقافة المتوسطة مع مجموعة من جرعات التستوستيرون على مدى 10 أيام، ولاحظ أن تركيز10-7 M من هرمون تستوستيرون زيادة تجنيد الجريب، والبقاء على قيد الحياة، وزيادة تطور بصيلات المرحلة المبكرة19. في عام 2007 ، وذلك باستخدام ثقافات قشرة المبيض من الأجنة البقرية (5-8 أشهر من الحمل) ، يانغ وفورتشن ذكرت دورا في عامل النمو البطانية الوعائية ألف (VEGFA) في المرحلة الانتقالية الأولية إلى الثانوية بصيلات21. وعلاوة على ذلك، استخدم مختبرنا ثقافات قشرة المبيض لإظهار كيف يمكن لأشكال VEGFA (الأوعية، ومضادات الأوعية، والجمع) تنظيم مسارات نقل الإشارات المختلفة من خلال مستقبلات مجال كيناز (KDR)، وهو مستقبل نقل الإشارات الرئيسي الذي يربط VEGFA16. سمحت هذه المعلومات بفهم أفضل لكيفية تأثير أشكال VEGFA المختلفة على مسارات الإشارات للحصول على تطور الجريب أو الاعتقال. معا, زراعة قطع قشرة المبيض في المختبر مع المنشطات المختلفة أو عوامل النمو يمكن أن يكون المقايسة قيمة لتحديد الآثار على الآليات التي تنظم تولد الجريبية. وبالمثل، قد تكون الحيوانات التي يتم تطويرها على أنظمة غذائية مختلفة قد غيرت البيئات الدقيقة المبيضية، والتي قد تعزز أو تمنع تكوين الجريبات التي تؤثر على النضج الإنجابي للإناث. وهكذا، هدفنا في المخطوطة الحالية هو الإبلاغ عن تقنية ثقافة قشرة البقر وتحديد ما إذا كانت هناك اختلافات في البيئات الدقيقة المبيض بعد الثقافة المختبرية من قشرة البقر من heifers تغذية إما التحكم أو درج الخطوة الوجبات الغذائية التي تم جمعها في 13 شهرا من العمر كما هو موضح سابقا16.
لذلك ، كانت خطوتنا التالية هي تحديد البيئة الدقيقة المبيض في هذه الهيفر التي تم تطويرها مع الوجبات الغذائية المختلفة. قمنا بتقييم قشرة المبيض من heifers تتغذى إما مع درج الخطوة أو السيطرة على النظام الغذائي. وعرضت الضوابط heifers حمية صيانة 97.9 غرام / كغ0.75 لمدة 84 يوما. بدأ النظام الغذائي درج الخطوة في 8 أشهر تحتوي على نظام غذائي تغذية مقيدة من 67.4 غرام / كجم0.75 لمدة 84 يوما. بعد الأيام ال 84 الأولى ، في حين واصلت السيطرة heifers لتلقي 97.9 غرام / كغ0.75، وعرضت على درج خطوة لحوم البقر heifers 118.9 غرام / كجم0.75 لمدة 68 يوما أخرى ، وبعد ذلك تم استئصال المبيضين في 13 شهرا من سن16 لدراسة التغيرات في المراحل الجريبية ومورفولوجيا قبل وبعد الثقافة. نحن أيضا المقايسة للاختلافات في المنشطات, نواتج الأيض الستيرويد, chemokines, والسيتوكينات تفرز في وسائل الإعلام القشرة. تم قياس المنشطات وغيرها من الأيض لتحديد ما إذا كان هناك أي آثار مباشرة من العلاجات التي أجريت في الجسم الحي و / أو في المختبر على صلاحية الأنسجة والإنتاجية. قدمت التغيرات في البيئة الدقيقة المبيض قبل وبعد الثقافة لمحة عن بيئة الغدد الصماء وتولد الجريبات قبل الثقافة وكيف تؤثر الثقافة أو العلاج أثناء الثقافة على تطور الجريب أو الاعتقال.
تم جمع المبيضين بعد إجراء استئصال المبيضين في الولايات المتحدة. مركز أبحاث اللحوم الحيوانية (USMARC) وفقا لإجراءات IACUC من التحكم ودرج الخطوة heifers في 13 شهرا من العمر16، وتنظيفها مع المحلول الملحي العازلة الفوسفات العقيمة (PBS) يغسل مع 0.1 ٪ من المضادات الحيوية لإزالة الدم والملوثات الأخرى ، قلصت الأنسجة الزائدة ، ونقلها إلى جامعة نبراسكا لينكولن (UNL) مختبر علم وظائف الأعضاء التناسلية UNL في 37°C23 . في UNL، قطعت قطع قشرة المبيض إلى قطع مربعة صغيرة (~ 0.5-1 مم3؛ الشكل 1) ومثقف لمدة 7 أيام (الشكل 2). وقد أجريت الأنسجة على الشرائح ثقافة القشرة قبل وبعد الثقافة لتحديد مراحل بصيلات16،24 (الشكل 3 والشكل 4) ، والبروتينات مصفوفة خارج الخلية التي قد تشير إلى التليف (بيكو سيروس الأحمر ، PSR ؛ الشكل 5). سمح هذا بتحديد تأثير الأنظمة الغذائية في الجسم الحي على مراحل الجريب وسمح بالمقارنة بين 7 أيام من قشرة المبيض على مراحل الجريب وتطور الجريب. في جميع أنحاء الثقافة ، تم جمع الوسط وتغييره يوميا (تم جمع حوالي 70٪ من الوسائط كل يوم ؛ 250 ميكرولتر / بئر) بحيث يمكن تقييم الهرمونات اليومية / السيتوكينات / chemokines أو تجميعها على مدى أيام للحصول على متوسط التركيزات. المنشطات مثل أندروستينديون (A4) والاستروجين (E2) يمكن تجميعها على مدى 3 أيام وتقييمها من خلال التصوير الإشعاعي (ريا; الشكل 6) وتجمع على مدى 4 أيام لكل و المقايسة عن طريق قياس الطيف السائل كروماتوغرافيا الكتلة عالية الأداء (HPLC-MS)24،25 ( الجدول1). واستخدمت صفائف السيتوكين لتقييم تركيزات السيتوكين والكيموكين في زراعة قشرة المبيضالمتوسطة 26 (الجدول 2). في الوقت الحقيقي البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (RT-PCR) وأجريت لوحات المقايسة لتحديد التعبير الجيني لمسارات نقل إشارة محددة كما هو موضح سابقا16. كل من الستيرويد, السيتوكين, مرحلة الجريب وعلامات النسيجية توفير لقطة من البيئة المجهرية المبيض والقرائن على قدرة تلك البيئة الدقيقة لتعزيز “طبيعية” أو “غير طبيعية” تولد الجريبية.
فائدة ثقافة قشرة المبيض في المختبر ، كما هو موضح في هذه المخطوطة ، هي أن الجريبات تتطور في بيئة طبيعية مع ستروما مجاورة تحيط بصيلات. تبقى الخلايا الجسدية والبويضات سليمة، وهناك اتصال مناسب من خلية إلى خلية كنموذج في الجسم الحي. وقد وجد مختبرنا أن نظام الثقافة لمدة 7 أيام يوفر بيانات تكوين ا?…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا البحث المعهد الوطني للأغذية والزراعة 2013-67015-20965 إلى ASC، جامعة نبراسكا للمنح التنافسية الغذائية للصحة إلى ASC. وزارة الزراعة الأمريكية هاتش منح NEB26-202/W3112 الانضمام #1011127 إلى ASC, هاتش-NEB ANHL الانضمام #1002234 إلى ASC. مبادرة علوم الحياة الكمية دعم الباحثين الصيفيين بعد الدكتوراه – جائزة COVID-19 للتمويل الصيفي ل CMS.
ويود المؤلفون أن يقدموا تقديرهم للدكتور روبرت كوشمان، المركز الأميركي لأبحاث اللحوم، مركز كلاي، NE لشكره على توفير المبيضين في منشور سابق، والتي استخدمت بعد ذلك في الورقة الحالية كدليل على المفهوم في التحقق من صحة هذه التقنية.
#11 Scapel Blade | Swann-Morton | 303 | Scaple Blade |
#21 Scapel Blade | Swann-Morton | 307 | Scaple Blade |
500mL Bottle Top Filter | Corning | 430514 | Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium |
AbsoluteIDQ Sterol17 Assay | Biocrates | Sterol17 Kit | Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned |
Androstenedione Double Antibody RIA Kit | MPBio | 7109202 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
Belgium A4 Assay Kit | DIA Source | KIP0451 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
Bovine Cytokine Array Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | Cytokine kit to determine cytokines from culture medium |
cellSens Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | Imaging Software |
Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco ThermoFisher Scientific | 5150056 | Addative to the culture medium |
Leibovitz's L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet |
Microscope | Olympus | SZX16 | Disection microscope used for imaging tissue culture pieces |
Microscope Camera | Olympus | DP71 | Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces |
Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter | Millipore Sigma | PICM01250 | Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it |
Multiwell 24 well plate | Falcon | 353047 | Plate used to hold meduim, inserts, and tissues |
Petri dish 60 x 15 mm | Falcon | 351007 | Petri dish used for washing steps prior to culture |
Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) | Corning | 21-040-CV | Used for tissue washing |
SAS Version 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | Statistical analysis software |
Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue |
Waymouth MB 752/1 Medium | Sigma-Aldrich | W1625 | Medium used for tissue cultures |